【摘要】：一、研究背景和目的 登革病毒是黃病毒科黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒,由11kb的核酸編碼衣殼蛋白C,前膜蛋白prM和包膜蛋白E等3種結(jié)構(gòu)蛋白以及7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B,和NS5)。登革病毒主要以埃及伊蚊以及同屬伊蚊的白紋伊蚊為傳播媒介。依據(jù)數(shù)學模型的估計,全球每年約有5000萬感染病例發(fā)生,而在登革病毒流行的熱帶和亞熱帶地區(qū),發(fā)生率正在逐年上升。感染登革病毒后可能表現(xiàn)為無癥狀或輕微的自限性的發(fā)熱或登革熱(DF),但也可以發(fā)展為嚴重的危及生命的疾病即登革出血熱(DHF)和登革休克綜合征(DSS)。登革出血熱(DHF)和登革休克綜合征(DSS)的主要癥狀是血管內(nèi)血液的流失伴隨著血細胞比容的上升、血壓的下降和漿液性滲出,這些均為疾病發(fā)展進展過程中血管內(nèi)皮損傷導致。 登革病毒曾經(jīng)被視為一種非神經(jīng)毒性病毒。由于因登革病毒引起神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例較少,這在一定程度上限制了登革病毒在神經(jīng)病學方向的發(fā)展。1976年,Sanguansermsri等首次將不同尋常的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)和登革病毒感染聯(lián)系在了一起。從那以后,在登革病毒感染發(fā)生病例中,描述與神經(jīng)系統(tǒng)癥狀相關(guān)癥狀的報告逐漸增多。雖然各種神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的確切發(fā)病率仍然不清楚,但是登革病毒感染時最常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥——腦病和腦炎的發(fā)病率則介于0.5%至6.2%之間。然而,在死于登革病毒感染的人群中,這個比例明顯高于那些從登革病毒感染中恢復的人群。巴西東北部Ceara'州的流行區(qū)域內(nèi),在致命性登革病毒感染人群中,中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀的發(fā)生率甚至高達48.8%。同時,最近的眾多觀察數(shù)據(jù)也表明,登革病毒感染的臨床表現(xiàn)正在發(fā)生改變,神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)的報道也更為頻繁。 登革病毒感染引起的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀曾經(jīng)被認為是由血液的外滲、腦水腫、低鈉血癥、肝或腎功能衰竭而引起的腦病,而不是由于登革病毒侵犯局部中樞神經(jīng)系統(tǒng)而導致的腦炎。然而,一例兒童尸檢的組織學檢查中找到了登革病毒抗原的報告,證明了登革病毒性腦炎的存在。同時,在登革病毒性腦炎患者的腦脊液(CSF)中分離出登革病毒,運用免疫組化,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)等技術(shù)在下橄欖核以及小腦的顆粒層中檢測到了登革病毒的存在,在神經(jīng)元,小膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞中也觀察到了登革病毒的免疫原性反應,這些均為登革病毒擁有神經(jīng)毒性提供了強而有力的證據(jù)。 眾所周知,血腦屏障(BBB)是一個介于血液循環(huán)系統(tǒng)和腦組織之間的對物質(zhì)通過有選擇性阻礙作用的獨特膜性結(jié)構(gòu),血腦屏障可以保護大腦免受有害物質(zhì)的入侵。血腦屏障主要由三個功能性結(jié)構(gòu)組成：(1)物理屏障,由細胞間的緊密連接組成(2)低效率內(nèi)吞作用的細胞們本身(3)代謝屏障,主要由內(nèi)皮細胞表達的特定膜轉(zhuǎn)運蛋白起作用。然而,即使有這個屏障,一些病毒如登革熱病毒,西尼羅河病毒和東部馬腦炎病毒仍然能夠通過一些未知的機制進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)。 由于組成血腦屏障的細胞們直接暴露于外周血液系統(tǒng)中的游離病毒中,那么登革病毒在作為血腦屏障細胞重要組成的人腦微血管內(nèi)皮細胞中感染和復制,可能成為登革病毒進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的一個重要途徑。病毒感染血腦屏障中的血管內(nèi)皮細胞導致血腦屏障的性能改變的機制已經(jīng)在幾種病毒的感染機制中得以體現(xiàn),特別是那些能夠?qū)е录毙陨窠?jīng)退行性疾病和神經(jīng)炎癥的病毒,比如猴免疫缺陷病毒(SIV)、麻疹病毒和人類T-淋巴細胞白血病病毒。此外,游離的登革病毒也可以在不改變血的腦屏障完整性的情況下通過轉(zhuǎn)吞胞作用機制通過血腦屏障�；蛘�,通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達從而允許游離的病毒以及病毒感染后的細胞得以進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。例如,艾滋病毒和猴免疫缺陷病毒感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)時即能夠誘導腦微血管細胞的緊密連接蛋白(TJP)和細胞粘附分子(CAM)的表達發(fā)生改變,導致帶有高病毒載量的被感染炎癥細胞以“特洛伊木馬”的形式進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。此外,動物研究已經(jīng)表明,登革病毒感染時能夠使得IFN-γ、IL-6和MCP-1等細胞因子釋放增加,導致登革病毒更容易突破血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。因此,本研究則以描述登革病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細胞為特點,重點研究其感染對緊密連接蛋白(TJP)和粘附蛋白(CAM)的表達。同時,被感染細胞上清的中的細胞因子的變化也是重點監(jiān)測對象。 二、研究方法 1.登革3型病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)的感染動力學研究冰上仔細研磨實驗室儲存的登革3型乳鼠鼠腦,獲取病毒原液后感染單層C6/36細胞,置于28℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),逐日觀測細胞,待約超過80%細胞出現(xiàn)CPE時,收集細胞及上清,以獲取病毒富集液；采用TCID50的方法對富集的病毒液進行毒力滴定后,以感染復數(shù)(MOI)為5的病毒量感染HBMEC,于24h,48h,72h,96h觀測HBMEC的CPE現(xiàn)象；收集該時間點感染后的細胞上清,采用Taqman探針法RT-PCR的方法,檢測其中病毒拷貝數(shù)的變化以確定登革3型病毒能否感染HBMEC并能在其中進行復制；采用免疫熒光檢測技術(shù),檢測以上時間點的細胞中登革3型病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的表達變化情況,以進一步確定登革3型病毒感染HBMEC的感染方式。 2.登革3型病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)對血腦屏障中緊密連接的影響 采用Primer5.0以及Oligo7.0設計與評估人血腦屏障緊密連接相關(guān)的蛋白基因ZO-1,Claudin-1, Occludin-1的上下游引物；收集MOI為5的登革3型病毒感染后不同時間點的HBMEC細胞,采用RNA提取試劑盒提取不同時間點細胞的mRNA,然后采用SYBG染料法的RT-QPCR檢測這些緊密連接相關(guān)基因在感染后不同時間點的變化；收集MOI為5的登革3型病毒感染后不同時間點的HBMEC細胞,采用RIPA裂解液裂解后獲取細胞蛋白,采用Western-blot技術(shù),檢測細胞中緊密連接相關(guān)蛋白在感染后的變化趨勢,以評估登革3型病毒感染HBMEC后對血腦屏障緊密連接產(chǎn)生的影響。 3.登革3型病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)后對白細胞粘附的影響。 采用Primer5.0以及Oligo7.0設計與評估人血腦屏障中與白細胞粘附相關(guān)的蛋白基因RANTES, E-selectin, PEC AM, VCAM-1, ICAM-3的上下游引物；收集MOI為5的登革3型病毒感染后24h,48h,72h,96h不同時間點的HBMEC細胞,采用RNA提取試劑盒提取不同時間點細胞的mRNA,然后采用SYBG染料法的RT-QPCR檢測這些與白細胞粘附相關(guān)基因在感染后不同時間點的變化；收集MOI為5的登革3型病毒感染后不同時間點的HBMEC細胞,采用RAIP裂解液裂解后獲取細胞蛋白,采用Western-blot技術(shù),檢測在RT-QPCR中顯示變化明顯的白細胞粘附蛋白在感染后的變化趨勢,以評估登革3型病毒感染HBMEC后對血腦屏障緊密連接產(chǎn)生的影響。 4.登革3型病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)后上清中細胞因子的變化。 收集MOI為5的DV3感染后24h,48h,72h不同時間點的HBMEC培養(yǎng)上清以及未感染時的細胞培養(yǎng)上清各2ml,采用基于夾心法ELISA原理的蛋白芯片檢測這些時間點上細胞因子的變化趨勢,對于蛋白芯片檢測出有意義的細胞因子,采用western-blot方法對這些細胞因子進行進一步的確認。 三、結(jié)果 1.登革3型病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)的感染動力學研究 登革3型病毒能夠感染HBMEC,并在其中復制。通過光學顯微鏡觀察感染后HBMEC,可見隨著感染時間的延長,HBMEC逐漸縮小,變圓,并從培養(yǎng)瓶上脫落漂浮于培養(yǎng)液中；而感染后的細胞上清中登革病毒拷貝數(shù)逐漸減小,及病毒滴度上升；感染后的HBMEC采用免疫熒光技術(shù)觀察后可見細胞中NS1表達比例逐漸增加。 2.登革3型病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)對血腦屏障中緊密連接的影響 采用QPCR檢測與人血腦屏障緊密連接相關(guān)的蛋白基因ZO-1, Claudin-1, Occludin-1中, ZO-1, Claudin-1均于感染后24h后會應激性的增加mRNA的表達量,而后其表達量又會急速下降至正�；蚋�,隨著感染時間的延長,逐漸恢復到正常水平。Western-blot進一步確認時,ZO-1, Occludin-1均在感染的第2天出現(xiàn)表達高峰,而后逐漸降低,到第四天最為明顯。而Occludin-1的mRNA表達量微小的增加在WB分析中沒有檢測到有意義的變化。3.登革3型病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)后對白細胞粘附的影響。 采用QPCR檢測與人血腦屏障細胞粘附相關(guān)的蛋白基因RANTES, E-selectin, PEC AM, VCAM-1, ICAM-3中, VCAM-1與RANTES均于感染后48h后明顯的增加,VCAM-1最大高峰為感染后第二天,并持續(xù)高于對照組,RANTES較早時期與正常水平接近,最大高峰為感染后第三天。而在采用Western-blot進一步確認時,僅RANTES的蛋白表達量與QPCR結(jié)果一致,而VCAM-1的表達沒有檢測到有意義的變化。E-selectin, PECAM在感染后的mRNA及WB檢測中均沒有明顯變化。4.登革3型病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)后上清中細胞因子的變化。 對于未感染組和感染后的24h,48h,72h的細胞培養(yǎng)上清,同時檢測了常見的23種與白細胞趨化、炎癥反應、抗病毒等密切相關(guān)的細胞因子,其中GM-CSF、IL-13、MCP-2、MIG、RANTES等在感染后24h,48h,72h的量超過對照組的1.5倍,IFN-7以及MCP-1同樣有輕度的增加,對于這些因子是否有確切的意義需要進一步的western-blot檢測。四、結(jié)論1.作為血腦屏障重要組成的HBMEC,在登革3型病毒感染HBMEC的感染動力學研究中,我們通過感染后的CPE現(xiàn)象,感染后細胞上清中病毒拷貝數(shù)qRT-PCR,感染后細胞中NS1的表達的免疫熒光檢測,證實了登革3型能夠感染HBMEC導致其產(chǎn)生CPE現(xiàn)象,同時能夠在其中復制且能夠?qū)椭频淖哟《踞尫诺脚囵B(yǎng)的細胞上清中。這種感染方式和登革病毒的易感細胞如單核細胞及BHK-21類似能夠持續(xù)在細胞中復制,并伴隨著CPE。因此,可以猜測登革3型病毒能夠直接感染HBMEC并釋放病毒,這種細胞穿胞途徑可能成為登革3型病毒跨越血腦屏障進入CNS的途徑之一。 2.在本研究中,登革3型病毒感染HBMEC后能夠?qū)ρX屏障中緊密連接的相關(guān)的基因如ZO-1以及Claudin-1在mRNA水平的表達呈現(xiàn)為感染首日應激性大幅度的增加,而在感染的隨后幾日中又會下降到正常水平或接近正常水平,在相應蛋白的WB檢測中,ZO-1的表達同樣在首日應激性增加后,隨后感染的幾日的表達相對未感染組下調(diào),這可能是緊密連接蛋白對感染后細胞釋放的細胞因子的一種應答表現(xiàn)。而ZO-1在連接跨膜蛋白與細胞骨架蛋白之間起著重要的中心作用,而隨著感染時間的延長,其表達量的下降可能導致血腦屏障滲透性增加,使得登革3型病毒能夠通過細胞旁途徑進入CNS。 3.被感染的單核巨噬等易感細胞能夠以“特洛伊木馬”的形式進入CNS,使得病毒更易在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞中擴散。而被感染的HBMEC能夠?qū)е掳准毎掣较嚓P(guān)的蛋白(CAM)以及趨化其粘附的RANTES表達上調(diào),這些蛋白能夠促進被感染的單核巨噬細胞更容易進入CNS,這表明“特洛伊木馬”機制可能是形成登革腦炎的一個重要原因。 4.在登革3型病毒感染HBMEC后的細胞上清中,GM-CSF、IL-13、MCP-2、 MIG、RANTES等細胞因子的表達量出現(xiàn)超過1.5倍的上升,IFN-7以及MCP-1同樣有輕度的增加。而在研究已經(jīng)表明這些細胞因子主要與白細胞的趨化、生成及成熟均有密切的關(guān)系,而上清中RANTES與被感染的細胞中的表達趨勢保持一致,這些都表明了登革3型病毒感染HBMEC時,能夠形成局部的炎癥反應,趨化白細胞的聚集以及作用。這些將在后續(xù)的研究中得到進一步的證實。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R373

【參考文獻】

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本文編號：2312989