【摘要】： 天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵御外來(lái)微生物抗原入侵的第一道防線。自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分,是機(jī)體抗御感染和防止細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。NK細(xì)胞不表達(dá)典型的抗原識(shí)別受體,不需預(yù)先活化就能夠識(shí)別并殺傷異常細(xì)胞,并迅速分泌可溶性因子包括趨化因子和細(xì)胞因子,在機(jī)體抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和造血調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。NKT細(xì)胞也是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要的細(xì)胞群體,它既表達(dá)特異性的T細(xì)胞的標(biāo)志,又表達(dá)NK細(xì)胞的標(biāo)志,通過(guò)分泌細(xì)胞因子和殺傷功能在對(duì)感染、腫瘤、移植、自身免疫性疾病、炎癥等的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。 IL-2與IL-15是γc家族細(xì)胞因子的成員,它們是重要的細(xì)胞生長(zhǎng)因子,能夠調(diào)控淋巴細(xì)胞的增殖、活化和生存。雖然IL-2和IL-15受體含有相同的β和γ亞單位,能夠活化下游共同的JAK-STAT等信號(hào)通路,但是在許多適應(yīng)性免疫應(yīng)答中,IL-2和IL-15表現(xiàn)出了不同的甚至相反的功能。臍血中含有大量未成熟的細(xì)胞和造血前體細(xì)胞,具有分化潛能,研究這些細(xì)胞在IL-2和IL-15作用下的發(fā)育分化情況,將有利于發(fā)現(xiàn)些許天然免疫細(xì)胞發(fā)育分化的線索,以及IL-2和IL-15在其中的不同作用,為以臍血天然免疫細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物治療提供理論依據(jù)。 NK92細(xì)胞是一種自然殺傷細(xì)胞系,具有與人活化的NK細(xì)胞相似的表型特征和功能特點(diǎn),是研究NK細(xì)胞功能的很好的工具。NK92細(xì)胞無(wú)需抗原預(yù)先作用,就可直接殺傷腫瘤和病毒感染的靶細(xì)胞,可在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)大量擴(kuò)增,具有廣譜抗腫瘤作用,使其成為一種有效的免疫治療劑。我們對(duì)NK92細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的可能的殺傷機(jī)制進(jìn)行了探索,以期為有效的NK細(xì)胞治療的提供線索。 本實(shí)驗(yàn)中,我們分離臍血單個(gè)核細(xì)胞,分別加入IL-2和IL-15進(jìn)行培養(yǎng),采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的表型以及各細(xì)胞群體的比例,結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)推算各細(xì)胞群體的細(xì)胞數(shù)量;利用ELISA方法和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù),檢測(cè)特定細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌情況;利用Annexin V染色和胞內(nèi)Bcl-2和Bcl-xL染色,分析細(xì)胞亞群的凋亡情況;利用MACS和FACS純化細(xì)胞,檢測(cè)特定純化細(xì)胞在不同刺激因素作用下的變化情況;利用~(51)Cr釋放法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞與細(xì)胞的結(jié)合和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的活化;利用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)和熒光抗體,觀察細(xì)胞-細(xì)胞之間的免疫突觸,相關(guān)分子在細(xì)胞表面分布的情況以及信號(hào)分子的活化。通過(guò)上述研究方法,我們初步獲得了以下結(jié)果以及結(jié)論: 1.臍血NK細(xì)胞活性低與其高表達(dá)NKG2A/CD94和低表達(dá)顆粒酶B有關(guān) 首先我們對(duì)臍血NK細(xì)胞的比例和殺傷功能的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),盡管臍血NK細(xì)胞和CD8~+ NK細(xì)胞的比例都高于外周血,但是臍血NK細(xì)胞的殺傷功能卻顯著低于外周血NK細(xì)胞。分析NK細(xì)胞受體的表達(dá)發(fā)現(xiàn),活化性NK細(xì)胞受體CD16,NKG2D和NKp46的表達(dá)在臍血和外周血NK細(xì)胞沒(méi)有差異,但是抑制性NKG2A/CD94受體的表達(dá)在臍血NK細(xì)胞明顯增高。對(duì)于殺傷效應(yīng)分子的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),顆粒酶B在臍血NK細(xì)胞的表達(dá)明顯低于外周血NK細(xì)胞,而細(xì)胞內(nèi)穿孔素,IFN-γ,TNF-α的表達(dá),以及膜表面FasL和TRAIL的表達(dá)在臍血和外周血NK細(xì)胞沒(méi)有明顯差異。 綜上所述,抑制性NKG2A/CD94受體的高表達(dá)和顆粒酶B的低表達(dá)與臍血NK細(xì)胞活性低有關(guān)系。 2.IL-15抗臍血CD56~(dim)細(xì)胞凋亡的作用與Bcl-xL有關(guān) 比較分析IL-2和IL-15對(duì)臍血NK細(xì)胞的作用發(fā)現(xiàn),IL-15能夠促進(jìn)CD56~(bright)NK細(xì)胞和CD56~(dim)NK細(xì)胞的增殖,而IL-2只能維持CD56~(bright)NK細(xì)胞的生存。IL-15培養(yǎng)的NK細(xì)胞凋亡的比例明顯低于IL-2,凋亡細(xì)胞大都為CD56~(dim)NK細(xì)胞,而且抗IL-2的中和抗體能夠協(xié)同IL-15減少NK細(xì)胞的凋亡。應(yīng)用純化的CD56~(dim)NK細(xì)胞做進(jìn)一步研究得到同樣的結(jié)果。對(duì)抗凋亡蛋白的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Bcl-2的表達(dá)在IL-2和IL-15培養(yǎng)的CD56~(brigh)NK細(xì)胞和CD56~(dim)NK細(xì)胞中沒(méi)有明顯差異;與IL-2相比,IL-15培養(yǎng)的NK細(xì)胞表達(dá)高水平的Bcl-xL,而目CD56~(bright)NK細(xì)胞Bcl-xL的表達(dá)高于CD56~(dim)NK細(xì)胞。這提示,Bcl-xL在IL-15抗NK細(xì)胞凋亡中起重要作用。此外,對(duì)IL-2Rα和IL-15Rα的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),IL-15能夠顯著上調(diào)NK細(xì)胞IL-2Rα的表達(dá)并能更好的維持IL-15Rα的表達(dá)。 綜上所述,IL-2促進(jìn)CD56~(dim)NK細(xì)胞凋亡而IL-15能夠抑制其捌亡,IL-15的抗凋亡作用與Bcl-xL的高表達(dá)相關(guān)。因此IL-15在維持CD56~(dim)NK細(xì)胞的長(zhǎng)期的功能中起重要作用。 3.IL-2和IL-15對(duì)臍血NKT樣細(xì)胞的發(fā)育和活化產(chǎn)生不同的作用 利用體外長(zhǎng)期臍血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),CD3~+CD56~+ NKT樣細(xì)胞由CD34~-CD56~-細(xì)胞發(fā)育而來(lái),CD34~+細(xì)胞和CD56~+細(xì)胞在IL-2或者IL-15的作用下只能產(chǎn)生極少量的NKT樣細(xì)胞。IL-2促進(jìn)NKT樣細(xì)胞增殖的能力高于IL-15;但是IL-15培養(yǎng)的NKT樣細(xì)胞的活化程度(表達(dá)高水平的活化標(biāo)志CD161,CD25和IFN-γ)高于IL-2組而凋亡比例低于IL-2組。對(duì)Bcl-xL的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),IL-15培養(yǎng)的NKT樣細(xì)胞Bcl-xL的表達(dá)高于IL-2組。 綜上所述,IL-2能夠促進(jìn)NKT樣細(xì)胞增殖,但是IL-15可以更有效的活化NKT樣細(xì)胞,并使其維持更高的活性。IL-15的這些作用可能與其在GVHD中的致病作用有關(guān)系。 4.ERK1/2通路在以CD11a和CD2為基礎(chǔ)的NK92細(xì)胞的殺傷中起重要作用 首先利用流式細(xì)胞術(shù)能夠檢測(cè)到NK92細(xì)胞與靶細(xì)胞的結(jié)合,而且NK92細(xì)胞的殺傷活性與效靶細(xì)胞結(jié)合的比例有關(guān),結(jié)合率越高,殺傷功能越強(qiáng)。許多因素都能影響NK92與靶細(xì)胞的結(jié)合,如抑制性NK受體的表達(dá),細(xì)胞膜流動(dòng)性的破壞,EDTA等。對(duì)細(xì)胞粘附分子的研究發(fā)現(xiàn),CD11a和CD2在NK92細(xì)胞和K562細(xì)胞相互作用的界面上有聚集現(xiàn)象,提示二者可能在NK92細(xì)胞結(jié)合K562細(xì)胞過(guò)程中起重要作用。K562細(xì)胞與NK92細(xì)胞的相互作用能夠活化NK92細(xì)胞的ERK1/2通路,抑制ERK1/2的磷酸化顯著降低NK92細(xì)胞的殺傷功能。 綜上所述,NK92細(xì)胞結(jié)合靶細(xì)胞是其行使殺傷功能的先決條件。效靶結(jié)合活化NK細(xì)胞的ERK1/2信號(hào)通路也在NK92細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞中起重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2309091