【摘要】： 肝的免疫耐受狀態(tài)與肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關,它不僅可以在免疫性肝炎中發(fā)揮作用,也可以決定感染性肝臟疾病的免疫應答程度。如嚴重危害生命健康的乙肝、丙肝,由于機體免疫系統(tǒng)對病毒及其抗原反應低下或特異性耐受,患者臨床表現(xiàn)為持續(xù)病毒感染狀態(tài),肝臟長期存在慢性炎癥與肝細胞增殖性改變,最終發(fā)展為肝硬化、肝癌,若將耐受狀態(tài)逆轉為應答狀態(tài)則可有效清除肝炎病毒,改善疾病癥狀;另一方面,肝免疫耐受的成功誘導能延長移植肝的存活,是提高生存質量的重要手段。近年來,在對自身免疫性肝炎發(fā)病機制的研究中發(fā)現(xiàn),機體在易感性基因的作用下,受環(huán)境因子、藥物或感染因子的誘導,導致肝自身免疫耐受狀態(tài)削弱,產生針對肝細胞膜自身靶抗原的細胞免疫與體液免疫反應,造成自身免疫性肝損傷。如何抑制自身免疫應答,維持免疫耐受狀態(tài),是目前的研究熱點。 調節(jié)性T細胞因其在維持機體自身免疫耐受狀態(tài)中的關鍵作用而日益受到重視,根據(jù)來源及功能不同,調節(jié)性T細胞可分為多個亞群,包括CD4~+ CD25~+調節(jié)性T細胞、Tr1(Tr1 regulatory T cell,Tr1 cell)調節(jié)性T細胞和Th3等,它們的功能異常是自身免疫性疾病如類風關、自身免疫性肝損傷等的重要的免疫學發(fā)病機制,其中Tr1調節(jié)性T細胞(Tr1細胞)在自身免疫性疾病中的抑制作用備受關注。Tr1調節(jié)性T細胞以高分泌IL-10為主要特征,具有低增殖性,主要通過其分泌的IL-10抑制初始和記憶性Th1和Th2的反應。另外,在外源IL-10的刺激下初始CD4~+ T細胞可以被誘導為Tr1調節(jié)性T細胞。已有研究證明Tr1細胞在口服和系統(tǒng)性全身免疫耐受中均發(fā)揮重要作用,但Tr1細胞在肝免疫耐受中的作用及其機制研究甚少。 基于此,為了闡明Tr1細胞在肝臟免疫耐受中的作用,我們建立了ConA誘導的小鼠肝免疫耐受模型,探討Tr1調節(jié)性T細胞在其中的作用及其機制,以期為自身免疫性肝炎的治療和維持肝移植的免疫耐受提供實驗和理論依據(jù)。 第一部分ConA誘導的小鼠肝免疫耐受模型的建立 我們以亞致死劑量ConA預處理、致死劑量ConA再次攻擊小鼠建立肝免疫耐受模型。第0天,以亞致死劑量ConA預處理Balb/c小鼠,生理鹽水預處理組作為對照,第8天分別給予兩組小鼠致死劑量ConA誘導小鼠急性肝損傷,再次ConA給予8小時后檢測血清轉氨酶(ALT)和肝病理損傷的變化。從血清學指標來看,ConA預處理組小鼠血清轉氨酶(ALT)水平較生理鹽水預處理組小鼠顯著降低;小鼠肝組織病理檢查結果顯示,ConA預處理組僅有極少的炎性細胞浸潤,生理鹽水預處理組顯示大量浸潤的炎性細胞在肝組織擴散并導致局部肝細胞壞死。因此通過以上結果證明我們成功誘導了肝免疫耐受,建立了ConA誘導的肝免疫耐受模型。 第二部分Tr1調節(jié)性T細胞在ConA誘導的肝免疫耐受模型中的作用 在成功建立ConA誘導的肝免疫耐受模型的基礎上,我們聚焦在T淋巴細胞,觀察脾臟中T淋巴細胞數(shù)量和比例的變化,結果發(fā)現(xiàn):與對照組相比較,ConA預處理組的CD4~+ T和CD8~+ T細胞絕對數(shù)目明顯增加,ELISA和流式檢測的結果均提示CD4~+ T細胞具有Tr1調節(jié)性T細胞表型(IL-10~+,IL-4~-,IFN-γ~-,Foxp3~-);同時,胞內細胞因子染色檢測發(fā)現(xiàn)Tr1調節(jié)性T細胞在肝臟和脾臟中的比例明顯升高,且細胞表面高表達CD69和CD44分子,呈現(xiàn)活化表型,提示處于效應狀態(tài)。為了解Tr1細胞亞群在抵御ConA誘導的急性肝損傷中的作用,我們將ConA預處理組的CD4~+ T細胞轉輸正常小鼠,發(fā)現(xiàn)經轉輸具有Tr1調節(jié)性T細胞表型的ConA預處理組的CD4~+ T細胞的小鼠,可以抵御致死劑量ConA的攻擊;更進一步,我們以體外誘導的Tr1調節(jié)性T細胞過繼轉輸正常小鼠,以致死劑量ConA誘導急性肝損傷,同樣發(fā)現(xiàn)轉輸Tr1調節(jié)性T細胞能顯著抵御致死劑量ConA的攻擊,保護肝臟免受損傷。這些結果充分提示ConA誘導的肝免疫耐受模型通過誘導Tr1調節(jié)性T細胞發(fā)揮免疫抑制效應,介導肝免疫耐受。 第三部分Tr1調節(jié)性T細胞在ConA誘導的肝免疫耐受模型中的作用機制 為驗證Tr1調節(jié)性T細胞通過分泌IL-10發(fā)揮免疫抑制效應,我們以IL-10阻斷抗體體內作用,發(fā)現(xiàn)可以顯著逆轉Tr1調節(jié)性T細胞對ConA誘導的急性肝損傷的保護效應,表明Tr1調節(jié)性T細胞是通過抑制性細胞因子IL-10發(fā)揮其免疫調節(jié)作用的。進一步,為探討DCs在誘導Tr1調節(jié)性T細胞中的作用,我們檢測了ConA誘導的肝免疫耐受模型中DCs的成熟度和其分泌的細胞因子,結果發(fā)現(xiàn)ConA誘導的肝免疫耐受模型中DCs表現(xiàn)不成熟表型,并分泌較高量的IL-10,這一結果提示在肝免疫耐受模型中DCs不成熟和分泌較高量的IL-10可能參與了Tr1調節(jié)性T細胞的產生。因此,我們進一步分選了肝免疫耐受模型中CD11c~+DC細胞和na(?)ve CD4~+T細胞共培養(yǎng),觀察其是否可誘導Tr1調節(jié)性T細胞,結果發(fā)現(xiàn)肝免疫耐受模型中的CD11c~+DC細胞可以有效誘導Tr1調節(jié)性T細胞的產生;加入IL-10阻斷抗體,可以逆轉此作用。以上結果表明Tr1調節(jié)性T細胞主要通過IL-10發(fā)揮免疫調節(jié)作用,并且ConA誘導的肝免疫耐受模型中分泌IL-10的未成熟DCs參與了肝免疫耐受模型中Tr1調節(jié)性T細胞的誘導產生,這可能是ConA誘導的肝免疫耐受模型中Tr1調節(jié)性T細胞增加并發(fā)揮效應的一個重要機制。 通過上述研究,我們得到以下的結論: 1.成功建立ConA誘導的小鼠肝免疫耐受模型,明確了肝免疫耐受模型誘導了Tr1調節(jié)性T細胞,且呈活化表型。 2.Tr1調節(jié)性T細胞可以抵御ConA誘導的小鼠急性肝損傷,并通過其分泌細胞因子IL-10發(fā)揮抑制作用。 3.ConA誘導的小鼠肝免疫耐受模型通過不成熟DC分泌IL-10誘導了Tr1調節(jié)性T細胞的產生。 本研究闡明ConA誘導的肝免疫耐受模型通過不成熟DC分泌IL-10誘導了Tr1調節(jié)性T細胞的產生,并對致死劑量ConA的攻擊產生顯著的免疫保護效應,為臨床應用以免疫抑制細胞如Tr1調節(jié)性T細胞治療自身免疫性肝病提供新的思路和實驗依據(jù)。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：2309001