【摘要】： 研究背景 帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種常見于中老年人的進行性的中樞神經系統(tǒng)變性疾病。最新研究表明,在60歲以上的人口中PD的患病率約為1%,且患病危險性有隨著年齡增長而增加的趨勢。目前全球有400萬PD患者,而在中國就有170萬。世界衛(wèi)生組織預測2050年全球60歲以上人口將增加三倍,據(jù)此估計到時PD患者將達1500萬以上。PD不僅影響病人的生存質量,而且還給家庭和社會造成巨大的精神和經濟負擔。因此, PD病的防治已成為不容忽視的社會公共衛(wèi)生問題。 目前PD病因未明,亦無根治辦法。PD的藥物治療還只能在多巴胺(Dopamine,DA)代謝水平上進行對癥治療,主要藥物左旋多巴不能阻止疾病的進展,還可在2~5年內引起嚴重的運動障礙等并發(fā)癥。因此,探索新的治療方法迫在眉睫。目前PD的治療研究包括神經營養(yǎng)因子、基因治療、神經干細胞移植、抗體與疫苗和中醫(yī)藥等。在疾病的各種防治手段中,免疫治療是一種方便經濟的方法。其中疫苗的應用范圍日益擴大,神經變性疾病的疫苗治療已成為當今的研究熱點。疫苗治療阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的研究方興未艾,而PD的疫苗研究還處在初級階段。 Benner等首先在PD的疫苗治療方面作出了探索,用Cop-1免疫脾細胞進行過繼性轉移,對DA能神經元有保護作用。Masliah等用重組人類α-syn蛋白接種轉基因小鼠,產生了特異性的神經保護作用。免疫接種后可產生高親和力、高滴度的抗體,能識別人類α-syn的C末端表位;通過溶酶體途徑清除異常的α-syn蛋白,減少α-syn蛋白在DA能神經元和突觸的聚集。 這些研究表明選擇相關抗原免疫或制備相關抗體治療可能是PD治療的突破口之一。PD的主要病理改變是黑質致密部DA能神經元嚴重缺失,DA明顯減少;在殘存的神經元內出現(xiàn)Lewy小體。Lewy小體是PD的病理標志物,由多種蛋白異常蓄積所致,主要有α-syn、泛素、Parkin、14-3-3蛋白和synphilin-1等,其中α-syn蛋白是Lewy小體的主要構成成分。研究發(fā)現(xiàn)這幾種蛋白和PD的發(fā)病都有關系,而α-syn蛋白的異常改變起著關鍵作用。因此,α-syn蛋白是非常有希望的治療靶點。 但研究發(fā)現(xiàn)主動免疫可能會激發(fā)有害的炎癥反應。Aβ1-42免疫治療在動物模型上取得了成功,在臨床試驗中卻意外地出現(xiàn)了中樞神經系統(tǒng)炎癥反應和卒中,臨床試驗因此被迫終止。研究認為這種炎癥反應與細胞免疫激活有關,重組α-syn疫苗同樣可能遇到這個問題。但免疫佐劑的發(fā)展又給疫苗研究帶來了新的希望,尤其是核酸疫苗有著豐富的免疫佐劑可供選擇。免疫佐劑能增強免疫原性或改變免疫反應類型。核酸疫苗的免疫佐劑包括細胞因子、非甲基化胞苷酸鳥苷、共刺激分子等核酸片段,如IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、GM-CSF等。其中IL-10能使細胞免疫向體液免疫轉化,還可抑制炎癥反應。 現(xiàn)已開展了多種神經變性疾病的核酸疫苗研究,但至今無PD的相關研究。構建核酸疫苗,探索核酸疫苗的免疫原性、疫苗免疫類型的調控及中樞神經系統(tǒng)炎癥反應的規(guī)避,對PD與相關神經變性疾病的預防和治療都有重要意義。 研究目的 采用基因工程技術擴增人類α-syn基因和IL-10基因,構建表達人類α-syn蛋白的核酸疫苗,接種PD小鼠模型,觀察核酸疫苗對體液免疫的誘導和對PD小鼠中樞神經系統(tǒng)的保護作用,為開發(fā)PD的核酸疫苗提供理論和實驗依據(jù)。 方法 1.重組質粒pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10的構建和表達 用RT-PCR方法從人胚腦組織擴增人類α-syn基因,從人淋巴細胞擴增IL-10基因。將人類α-syn基因克隆到pVAX1質粒上構建重組質粒pVAX1-hαS140,融合IL-10基因和α-syn基因構建融合質粒pVAX1- hαS140-IL-10。進行限制性內切酶酶切分析和DNA測序鑒定。用重組質粒轉化大腸桿菌DH5α,抽提質粒,檢測合格后轉染COS-7細胞,用Western blot法檢測其生物學活性。 2.核酸疫苗對體液免疫的誘導 大量制備pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10兩種重組質粒和空質粒pVAX1。分別用重組質粒pVAX1-hαS140和pVAX1-hαS140-IL-10免疫正常的C57BL/6小鼠。采用肌肉注射,100μg/只/次,每三周加強免疫一次,共加強免疫5次。在初次免疫當天和在每次免疫后二周各采血一次,分離血清用于抗體測定。用免疫后的小鼠血清和能表達α-syn的小鼠腦組織行免疫組化反應及中和反應,觀察免疫血清抗體的特異性。 3.核酸疫苗的免疫保護作用觀察 用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6 tetrahydropyridine,MPTP)多次皮下注射正常的C57BL/6小鼠,5w后接種核酸疫苗,加強免疫3次,具體方法同前。觀察DA能細胞的酪氨酸羥化酶和α-syn蛋白的表達水平,比較pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140- IL-10免疫的保護效果。 結果 1.重組質粒pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10的構建和表達成功擴增人類α-syn和IL-10基因,并克隆到表達載體pVAX1上,經限制性內切酶酶切分析和DNA測序,表明重組質粒大小、方向和序列完全正確,成功構建重組質粒pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10,并在哺乳動物細胞COS-7中得到有效表達,經Western blot檢測具有較好的生物學活性。 2.核酸疫苗對體液免疫的誘導 大量制備核酸疫苗pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10和空質粒pVAX1,純度高,產量大。核酸疫苗免疫的動物血清有較高的抗體滴度,pVAX1-hαS140-IL-10組(3.591±0.54)×103,pVAX1-hαS140組(1.29±0.65)×103 (p0.01)。核酸疫苗免疫的小鼠血清和能和α-syn過表達的小鼠腦組織發(fā)生特異性的免疫組化反應,被α-syn蛋白中和的血清則不發(fā)生反應。 3.核酸疫苗的免疫保護作用觀察 核酸疫苗pVAX1-hαS140組、pVAX1-hαS140-IL-10組與空質粒pVAX1組比較,都有較好的免疫效果,p0.01,有差異顯著性。pVAX1-hαS140組與pVAX1-hαS140-IL-10組比較, 0.01p0.05,差異顯著性,pVAX1- hαS140-IL-10優(yōu)于pVAX1-hαS140。 結論 1.本研究成功構建了pVAX1- hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10兩種真核表達質粒,具有較好的生物學活性。 2.核酸疫苗免疫后的小鼠產生較高的抗體滴度, pVAX1- hαS140-IL-10組抗體滴度高于pVAX1- hαS140組。 3.核酸疫苗免疫可清除PD慢性小鼠模型腦內異常聚積的α-syn,從而減輕了過表達的α-syn對神經細胞的損害。pVAX1-hαS140-IL-10較pVAX1-hαS140有更好的保護效果。以人類α-syn為靶抗原的核酸疫苗是PD潛在的預防和治療手段。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392
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本文編號：2300490
