【摘要】： 研究背景 帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種常見于中老年人的進(jìn)行性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。最新研究表明,在60歲以上的人口中PD的患病率約為1%,且患病危險(xiǎn)性有隨著年齡增長而增加的趨勢。目前全球有400萬PD患者,而在中國就有170萬。世界衛(wèi)生組織預(yù)測2050年全球60歲以上人口將增加三倍,據(jù)此估計(jì)到時(shí)PD患者將達(dá)1500萬以上。PD不僅影響病人的生存質(zhì)量,而且還給家庭和社會(huì)造成巨大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此, PD病的防治已成為不容忽視的社會(huì)公共衛(wèi)生問題。 目前PD病因未明,亦無根治辦法。PD的藥物治療還只能在多巴胺(Dopamine,DA)代謝水平上進(jìn)行對(duì)癥治療,主要藥物左旋多巴不能阻止疾病的進(jìn)展,還可在2~5年內(nèi)引起嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)障礙等并發(fā)癥。因此,探索新的治療方法迫在眉睫。目前PD的治療研究包括神經(jīng)營養(yǎng)因子、基因治療、神經(jīng)干細(xì)胞移植、抗體與疫苗和中醫(yī)藥等。在疾病的各種防治手段中,免疫治療是一種方便經(jīng)濟(jì)的方法。其中疫苗的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大,神經(jīng)變性疾病的疫苗治療已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。疫苗治療阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的研究方興未艾,而PD的疫苗研究還處在初級(jí)階段。 Benner等首先在PD的疫苗治療方面作出了探索,用Cop-1免疫脾細(xì)胞進(jìn)行過繼性轉(zhuǎn)移,對(duì)DA能神經(jīng)元有保護(hù)作用。Masliah等用重組人類α-syn蛋白接種轉(zhuǎn)基因小鼠,產(chǎn)生了特異性的神經(jīng)保護(hù)作用。免疫接種后可產(chǎn)生高親和力、高滴度的抗體,能識(shí)別人類α-syn的C末端表位;通過溶酶體途徑清除異常的α-syn蛋白,減少α-syn蛋白在DA能神經(jīng)元和突觸的聚集。 這些研究表明選擇相關(guān)抗原免疫或制備相關(guān)抗體治療可能是PD治療的突破口之一。PD的主要病理改變是黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元嚴(yán)重缺失,DA明顯減少;在殘存的神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)Lewy小體。Lewy小體是PD的病理標(biāo)志物,由多種蛋白異常蓄積所致,主要有α-syn、泛素、Parkin、14-3-3蛋白和synphilin-1等,其中α-syn蛋白是Lewy小體的主要構(gòu)成成分。研究發(fā)現(xiàn)這幾種蛋白和PD的發(fā)病都有關(guān)系,而α-syn蛋白的異常改變起著關(guān)鍵作用。因此,α-syn蛋白是非常有希望的治療靶點(diǎn)。 但研究發(fā)現(xiàn)主動(dòng)免疫可能會(huì)激發(fā)有害的炎癥反應(yīng)。Aβ1-42免疫治療在動(dòng)物模型上取得了成功,在臨床試驗(yàn)中卻意外地出現(xiàn)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和卒中,臨床試驗(yàn)因此被迫終止。研究認(rèn)為這種炎癥反應(yīng)與細(xì)胞免疫激活有關(guān),重組α-syn疫苗同樣可能遇到這個(gè)問題。但免疫佐劑的發(fā)展又給疫苗研究帶來了新的希望,尤其是核酸疫苗有著豐富的免疫佐劑可供選擇。免疫佐劑能增強(qiáng)免疫原性或改變免疫反應(yīng)類型。核酸疫苗的免疫佐劑包括細(xì)胞因子、非甲基化胞苷酸鳥苷、共刺激分子等核酸片段,如IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、GM-CSF等。其中IL-10能使細(xì)胞免疫向體液免疫轉(zhuǎn)化,還可抑制炎癥反應(yīng)。 現(xiàn)已開展了多種神經(jīng)變性疾病的核酸疫苗研究,但至今無PD的相關(guān)研究。構(gòu)建核酸疫苗,探索核酸疫苗的免疫原性、疫苗免疫類型的調(diào)控及中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的規(guī)避,對(duì)PD與相關(guān)神經(jīng)變性疾病的預(yù)防和治療都有重要意義。 研究目的 采用基因工程技術(shù)擴(kuò)增人類α-syn基因和IL-10基因,構(gòu)建表達(dá)人類α-syn蛋白的核酸疫苗,接種PD小鼠模型,觀察核酸疫苗對(duì)體液免疫的誘導(dǎo)和對(duì)PD小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用,為開發(fā)PD的核酸疫苗提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 1.重組質(zhì)粒pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10的構(gòu)建和表達(dá) 用RT-PCR方法從人胚腦組織擴(kuò)增人類α-syn基因,從人淋巴細(xì)胞擴(kuò)增IL-10基因。將人類α-syn基因克隆到pVAX1質(zhì)粒上構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-hαS140,融合IL-10基因和α-syn基因構(gòu)建融合質(zhì)粒pVAX1- hαS140-IL-10。進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切分析和DNA測序鑒定。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,抽提質(zhì)粒,檢測合格后轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,用Western blot法檢測其生物學(xué)活性。 2.核酸疫苗對(duì)體液免疫的誘導(dǎo) 大量制備pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10兩種重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒pVAX1。分別用重組質(zhì)粒pVAX1-hαS140和pVAX1-hαS140-IL-10免疫正常的C57BL/6小鼠。采用肌肉注射,100μg/只/次,每三周加強(qiáng)免疫一次,共加強(qiáng)免疫5次。在初次免疫當(dāng)天和在每次免疫后二周各采血一次,分離血清用于抗體測定。用免疫后的小鼠血清和能表達(dá)α-syn的小鼠腦組織行免疫組化反應(yīng)及中和反應(yīng),觀察免疫血清抗體的特異性。 3.核酸疫苗的免疫保護(hù)作用觀察 用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6 tetrahydropyridine,MPTP)多次皮下注射正常的C57BL/6小鼠,5w后接種核酸疫苗,加強(qiáng)免疫3次,具體方法同前。觀察DA能細(xì)胞的酪氨酸羥化酶和α-syn蛋白的表達(dá)水平,比較pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140- IL-10免疫的保護(hù)效果。 結(jié)果 1.重組質(zhì)粒pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10的構(gòu)建和表達(dá)成功擴(kuò)增人類α-syn和IL-10基因,并克隆到表達(dá)載體pVAX1上,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析和DNA測序,表明重組質(zhì)粒大小、方向和序列完全正確,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10,并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞COS-7中得到有效表達(dá),經(jīng)Western blot檢測具有較好的生物學(xué)活性。 2.核酸疫苗對(duì)體液免疫的誘導(dǎo) 大量制備核酸疫苗pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10和空質(zhì)粒pVAX1,純度高,產(chǎn)量大。核酸疫苗免疫的動(dòng)物血清有較高的抗體滴度,pVAX1-hαS140-IL-10組(3.591±0.54)×103,pVAX1-hαS140組(1.29±0.65)×103 (p0.01)。核酸疫苗免疫的小鼠血清和能和α-syn過表達(dá)的小鼠腦組織發(fā)生特異性的免疫組化反應(yīng),被α-syn蛋白中和的血清則不發(fā)生反應(yīng)。 3.核酸疫苗的免疫保護(hù)作用觀察 核酸疫苗pVAX1-hαS140組、pVAX1-hαS140-IL-10組與空質(zhì)粒pVAX1組比較,都有較好的免疫效果,p0.01,有差異顯著性。pVAX1-hαS140組與pVAX1-hαS140-IL-10組比較, 0.01p0.05,差異顯著性,pVAX1- hαS140-IL-10優(yōu)于pVAX1-hαS140。 結(jié)論 1.本研究成功構(gòu)建了pVAX1- hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10兩種真核表達(dá)質(zhì)粒,具有較好的生物學(xué)活性。 2.核酸疫苗免疫后的小鼠產(chǎn)生較高的抗體滴度, pVAX1- hαS140-IL-10組抗體滴度高于pVAX1- hαS140組。 3.核酸疫苗免疫可清除PD慢性小鼠模型腦內(nèi)異常聚積的α-syn,從而減輕了過表達(dá)的α-syn對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害。pVAX1-hαS140-IL-10較pVAX1-hαS140有更好的保護(hù)效果。以人類α-syn為靶抗原的核酸疫苗是PD潛在的預(yù)防和治療手段。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392
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本文編號(hào)：2300490
