【摘要】： 目的 生、老、病、死是生命的自然規(guī)律。衰老是機(jī)體發(fā)育成熟以后伴隨著時間的推移體內(nèi)各種細(xì)胞、組織與器官逐漸發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能不可逆轉(zhuǎn)的、全面的衰退過程。最新研究認(rèn)為:生物體的衰老實(shí)際上是其體內(nèi)干細(xì)胞的衰老,所有的衰老現(xiàn)象包括組織器官退化、功能喪失、腫瘤發(fā)生和反復(fù)感染等都是成體干細(xì)胞衰老水平的具體表現(xiàn)。因此,深入研究干細(xì)胞衰老的機(jī)理對預(yù)防和治療老年性疾病有重要理論意義與臨床應(yīng)用價值。 實(shí)驗(yàn)證明,造血干細(xì)胞(HSC)的衰老與機(jī)體衰老有著密切的關(guān)系。HSC衰老是指細(xì)胞生長停滯,不可逆的停留在G1期,自我更新和多向分化能力降低,細(xì)胞數(shù)量減少,應(yīng)激性凋亡升高。HSC衰老可以引起機(jī)體造血功能和免疫功能的衰退、腫瘤發(fā)生率增加,并導(dǎo)致機(jī)體重要臟器結(jié)構(gòu)與功能的衰退。目前對HSC衰老機(jī)理還了解甚少,如果能闡明HSC衰老的生物學(xué)機(jī)理,尋找到延緩其衰老途徑,無疑對防治老年性疾病有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。衰老模型的構(gòu)建與相關(guān)生物學(xué)檢測是研究HSC衰老機(jī)理的重要基礎(chǔ)性工作,迄今仍未見理想和公認(rèn)的HSC體內(nèi)衰老模型。本研究以C57小鼠為研究對象,采用雄性供體HSC連續(xù)性移植建立小鼠的HSC復(fù)制性衰老的體內(nèi)模型,并通過整體、細(xì)胞和分子水平對HSC衰老的生物學(xué)特性進(jìn)行檢測,旨在為研究HSC衰老機(jī)理以及延緩其衰老的途徑提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 1.免疫磁性分選法(MACS)分離、純化雄性C57小鼠Sca-1+ HSC,流式細(xì)胞術(shù)(FCM)鑒定分選細(xì)胞純度,免疫熒光檢測分選HSC Sca-1+抗原的表達(dá),臺盼藍(lán)拒染法檢測分選Sca-1+HSC的活性。 2.用雄性供體HSC連續(xù)尾靜脈移植給雌性受體鼠,建立小鼠HSC復(fù)制性衰老體內(nèi)模型;經(jīng)PCR分析Y染色體基因,鑒定受體鼠造血細(xì)胞是否來源于雄性供體;觀察移植后受體鼠脾結(jié)節(jié)(CFU-S)形成數(shù)量、測定脾臟指數(shù),胸腺指數(shù),觀察移植HSC后受體鼠外周血血象指標(biāo)(WBC,RBC以及PLT)的恢復(fù),以觀察受體鼠造血功能重建情況。 3.采用造血祖細(xì)胞混合性集落(CFU-Mix)培養(yǎng)、細(xì)胞周期測定和衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β)染色,觀察連續(xù)移植所致衰老HSC自我更新和多向分化能力的生物學(xué)特點(diǎn)。 結(jié)果: 1.小鼠Sca-1+HSC分離純化及鑒定 流式細(xì)胞術(shù)檢測MACS前骨髓單個核細(xì)胞(MNCs)中Sca-1+ HSC百分比僅為1.7%;MACS分離純化后Sca-1+ HSC純度可達(dá)87.2%以上。免疫熒光觀察顯示,分選前MNCs中僅有極少數(shù)細(xì)胞表達(dá)Sca-1+抗原,MACS分離純化后標(biāo)記的細(xì)胞中見大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)Sca-1+抗原。臺盼藍(lán)拒染法檢測分選的Sca-1+HSC活性為96%～99%。提示分選的Sca-1+細(xì)胞有較高純度和活性。 2.供體HSC連續(xù)移植后受體鼠脾結(jié)節(jié)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及外周血血象檢測 2.1雄性供體HSC連續(xù)移植2次后,其在受體小鼠脾臟上形成CFU-S的能力下降。 2.2雄性供體HSC連續(xù)移植2次后,受體小鼠的脾臟和胸腺重量減輕,脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)皆有明顯下降。 2.3雄性供體HSC連續(xù)移植2次后,受體小鼠WBC,RBC、PTC以及HCT均有所降低,提示在連續(xù)移植中HSC的自我更新及重建造血的能力下降。 3. Y染色體檢測 經(jīng)Y染色體PCR分析,結(jié)果顯示受體鼠的造血細(xì)胞均能檢測出342bp的Y染色體序列(Sry序列),證明雌性受體小鼠重建造血的細(xì)胞來源于雄性供體小鼠HSC。 4.連續(xù)移植所致HSC衰老的生物學(xué)檢測 4.1隨著HSC連續(xù)移植代數(shù)的增加,其形成CFU-Mix集落數(shù)量和形成集落的細(xì)胞數(shù)明顯降低。 4.2隨著HSC連續(xù)移植代數(shù)的增加,細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯,其G0/G1期比例明顯增高,S期比例減少。 4.3隨著HSC連續(xù)移植代數(shù)的增加,SA-β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞百分比明顯增高。 結(jié)論: 1.采用MACS能成功、有效的分離、純化雄性C57小鼠Sca-1+ HSC,且細(xì)胞生物學(xué)活性良好。 2.雄性供體HSC移植能有效重建受體鼠造血功能。 3. Sca-1+ HSC連續(xù)尾靜脈移植能有效建立造血干細(xì)胞復(fù)制性衰老的體內(nèi)模型。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R-332

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本文編號：2298491