【摘要】： 自十九世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒以來(lái),大量的病毒學(xué)研究證實(shí),許多病毒與宿主在相互制約、相互抗衡中維系一種微生態(tài)平衡。一方面,機(jī)體免疫系統(tǒng)為防御病原微生物的侵襲,在進(jìn)化過(guò)程中建立了高度復(fù)雜、精細(xì)的抗感染免疫機(jī)制;另一方面,病原微生物也在進(jìn)化過(guò)程中獲得了各種各樣的免疫逃逸機(jī)制。例如,病毒可直接抑制宿主的免疫系統(tǒng)、通過(guò)抗原漂移乃至抗原轉(zhuǎn)換等機(jī)制避免宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊。 近年來(lái),MHC II分子介導(dǎo)的免疫識(shí)別在抗病毒免疫中的積極作用逐漸得到重視。MHC II分子的細(xì)胞分布較為狹窄,一般僅在抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)中高表達(dá),主要包括巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞和B細(xì)胞。MHC II分子的表達(dá)具有重要的生理意義,其表達(dá)上調(diào)可增加APC將抗原肽呈遞至CD4+T細(xì)胞的機(jī)會(huì),從而增強(qiáng)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答的水平。已證實(shí)人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1、人類(lèi)單純皰疹病毒HSV-1等均可通過(guò)影響MHC II分子依賴(lài)的免疫識(shí)別、逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。 EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)是在人群中造成最廣泛感染的病毒種類(lèi)之一。研究表明,90~95%以上的不同人種均有EBV感染史。大量的臨床研究表明,EBV與多種惡性腫瘤如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。此外,EBV感染帶來(lái)的嚴(yán)重問(wèn)題尚包括移植后淋巴增殖性疾病(post-transplant lymphoproliferative disease, PTLD)。 EBV主要感染人B細(xì)胞和上皮細(xì)胞。EBV在宿主細(xì)胞中以?xún)煞N形式存在:潛伏期和裂解期,前者不表達(dá)或僅表達(dá)少數(shù)幾種病毒蛋白;后者可表達(dá)近百種病毒蛋白。Zta是EBV的立早基因bzlf1的表達(dá)產(chǎn)物,作為堿性亮氨酸拉鏈(basic-leucine zipper, bZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一,在EBV的生活周期中發(fā)揮重要的作用。Zta是EBV活化時(shí)表達(dá)的第一個(gè)病毒蛋白,能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞中處于潛伏期的EBV進(jìn)入裂解期,引發(fā)病毒大量復(fù)制并造成病毒播散。宿主細(xì)胞中處于絕對(duì)潛伏期的EBV不表達(dá)任何病毒蛋白,此時(shí)無(wú)法鑒別攜帶EBV的細(xì)胞與正常細(xì)胞。目前認(rèn)為,清除進(jìn)入裂解期的EBV是控制EBV感染的關(guān)鍵。由于Zta蛋白是EBV進(jìn)入裂解期的關(guān)鍵分子和標(biāo)志物,因此Zta一直是EBV研究的重要靶分子。 MHC II分子限制性的CD4+ T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在機(jī)體控制皰疹病毒感染的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。前期研究發(fā)現(xiàn),EBV進(jìn)入裂解期后,宿主細(xì)胞中MHC II分子的表達(dá)顯著下調(diào)。值得注意的是,皰疹病毒顆粒在宿主細(xì)胞內(nèi)體中裝配,而內(nèi)體恰為MHC II分子與抗原肽結(jié)合的部位。由于B細(xì)胞既是EBV的主要宿主細(xì)胞之一,又是MHC II類(lèi)限制性免疫應(yīng)答的抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell, APC),我們推測(cè)EBV在進(jìn)入裂解期時(shí)有可能影響B(tài)細(xì)胞MHC II分子表達(dá)、干擾病毒抗原提呈。因此,本研究旨在探索EBV抑制宿主細(xì)胞MHC II分子表達(dá)的機(jī)制。 我們利用B淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞作為本研究的主要模型細(xì)胞,應(yīng)用TPA/NaB誘導(dǎo)Raji細(xì)胞中的EBV進(jìn)入裂解期,觀察到MHC II基因表達(dá)下調(diào)發(fā)生于轉(zhuǎn)錄水平,且與Zta的表達(dá)相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Zta表達(dá)導(dǎo)致MHC-II基因反式作用子(class II transactivator,CIITA)基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)受到抑制。我們通過(guò)生物信息學(xué)分析,在CIITA啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)2個(gè)未被報(bào)道的潛在的Zta結(jié)合位點(diǎn)(Zta response element, ZRE)。隨后通過(guò)啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)、染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和寡核苷酸沉降實(shí)驗(yàn),證實(shí)Zta可與CIITA基因啟動(dòng)子近端的ZRE221結(jié)合,從而抑制CIITA轉(zhuǎn)錄。對(duì)ZRE221進(jìn)行定點(diǎn)突變及應(yīng)用特異性siRNA抑制Zta表達(dá)可逆轉(zhuǎn)Zta對(duì)CIITA以及MHC II分子表達(dá)的抑制作用,從而揭示了B細(xì)胞內(nèi)裂解期EBV干擾MHC II分子限制性抗原提呈、逃逸宿主免疫清除的一個(gè)新的重要機(jī)制。 Zta除通過(guò)其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域參與調(diào)節(jié)宿主蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)外,還可通過(guò)其螺旋化螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain)與宿主蛋白發(fā)生直接的相互作用,進(jìn)而影響宿主蛋白的功能。已發(fā)現(xiàn)Zta可直接與宿主來(lái)源的蛋白如維甲酸受體、TATA結(jié)合蛋白、p53等發(fā)生相互作用,干擾這些蛋白在宿主細(xì)胞中執(zhí)行正常的功能。本研究的第二部分應(yīng)用免疫共沉淀及蛋白質(zhì)組學(xué)分析,尋找宿主細(xì)胞中能與Zta發(fā)生相互作用的蛋白,旨在揭示EBV—宿主相互作用、進(jìn)一步闡明EBV致病的分子機(jī)制,為抗病毒治療策略提供新的信息。 我們構(gòu)建了GST-Zta融合蛋白,通過(guò)GST沉降及質(zhì)譜分析,從宿主細(xì)胞中篩選到27種可能與Zta發(fā)生相互作用的蛋白,并利用Western blot對(duì)其中1種蛋白(CENP-E)進(jìn)行了驗(yàn)證,證實(shí)Zta與CENP-E在體外存在直接的相互作用。研究已發(fā)現(xiàn),CENP-E在細(xì)胞周期中可能參與紡錘體檢查點(diǎn)的控制,干擾CENP-E的表達(dá)可影響姐妹染色體在赤道板的排列,使細(xì)胞分裂阻滯于M期,或?qū)е路钦扼w子代細(xì)胞形成。鑒于CENP-E在細(xì)胞周期中的作用,我們對(duì)TPA/NaB誘導(dǎo)前后的Raji細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞周期分析,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的Raji細(xì)胞G2/M期群體比例從14.2%增至44.6%,提示誘導(dǎo)Raji細(xì)胞進(jìn)入EBV裂解期后引起的細(xì)胞周期阻滯可能與Zta影響CENP-E在細(xì)胞分裂中的功能有關(guān)。 綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn):(1)EBV進(jìn)入裂解期時(shí),Zta蛋白特異性地抑制CIITA及MHC II分子表達(dá)。(2)III型CIITA基因啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)功能性的ZRE(ZRE221),Zta可結(jié)合于ZRE221而抑制CIITA轉(zhuǎn)錄,此反式抑制作用依賴(lài)于Zta的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。(3)從誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞和過(guò)表達(dá)Zta的Hela細(xì)胞中篩選到27種可能與Zta發(fā)生直接相互作用的蛋白,證實(shí)其中1種蛋白(CENP-E)可與Zta結(jié)合。(4)誘導(dǎo)Raji細(xì)胞中EBV進(jìn)入裂解期,可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,此效應(yīng)可能與CENP-E/Zta的相互作用有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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3 王官清;王合;野l(fā)⒅筆，

本文編號(hào)：2295881