【摘要】：結核病(Tuberculosis, TB)是一種古老而漫長的感染性疾病,是長期危害人類健康的嚴重疾病之一。目前,全球大約有三分之一的人口感染了結核桿菌,每年約有300萬人死于結核病,平均每天死亡超過8000人。近年來,由于HIV和結核分枝桿菌雙重感染,以及耐藥結核分枝桿菌的流行,導致結核病的發(fā)病率和死亡率大幅度上升,形勢更加嚴峻。聯(lián)合國已將結核病列為21世紀重點控制的三大疾病之一�？ń槊�(BCG)作為唯一的能夠預防結核病的疫苗,雖然已在全球廣泛使用,但近期發(fā)現(xiàn)其保護效果不穩(wěn)定(0-80%),對成人幾乎無效,對已感染患者更是沒有治療作用,因此研制新型的抗結核疫苗刻不容緩。 預防性疫苗和治療性疫苗是新型抗結核疫苗的兩個主要發(fā)展策略,其中預防性疫苗研究得較多,包括DNA疫苗、蛋自疫苗、重組BCG疫苗、營養(yǎng)缺陷型疫苗、病毒載體疫苗等。本實驗針對重組BCG進行研究,通過將一些重要的結核桿菌抗原基因導入BCG,讓BCG大量表達保護性抗原,以期誘導比BCG強大而又持久的免疫保護力。 Ag85B和ESAT-6作為重要的抗結核保護性抗原已得到各國科學家公認,研究表明重組入Ag85B-EAST6的BCG (rBCG::Ag85B-EAST6)提高了抗結核保護作用。此外,重組多價抗原疫苗往往能夠比單一抗原疫苗激發(fā)更強的免疫反應,因此本實驗在選擇了保護性抗原Ag85B-EAST6融合抗原的基礎上又選擇了另外兩種保護性抗原,PPE蛋白Rv2608(PPE42)和Esx家族成員Rv3620c (EsxW),分別與Ag85B-ESAT6融合抗原聯(lián)合,以大腸桿菌-結核分枝桿菌穿梭質粒pMV261為載體,構建了兩株重組BCG菌株rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv2608與rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv3620c,均為國內外首次報道。將兩株重組BCG和傳統(tǒng)BCG疫苗分別免疫C57BL/6小鼠,通過ELISA檢測了抗體IgG水平IgG2b/IgG1水平和細胞因子(IFN-γ、 IL-2、IL-10等)分泌水平,用ELISPOT檢測了TNF-α陽性淋巴細胞水平,并用流式細胞儀檢測了CD4+T細胞亞群和CD8+T細胞亞群水平,分析比較各菌株的免疫原性。結果表明,與傳統(tǒng)BCG相比較,兩株重組BCG均可增強小鼠脾淋巴細胞在特異性抗原Ag85B和PPD刺激下細胞因子TNF-α和IL-2分泌水平,降低細胞因子IL-10分泌水平,顯示出更強的細胞免疫應答。同時,與傳統(tǒng)BCG相比較,rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv3620c誘導小鼠脾淋巴細胞產生更多的細胞因子IFN-γ,進一步增強Thl型細胞免疫反應。流式檢測結果表明,兩株重組BCG均可引起小鼠脾淋巴細胞特異性抗原Ag85B和PPD刺激下CD4+T細胞亞群和CD8+T細胞亞群分化水平提高,而CD4/CD8比值減小,顯示重組BCG能通過增強細胞毒作用提高機體的抗結核免疫保護作用。此外,兩株重組BCG均可引起抗原Ag85B特異性的體液免疫反應,與傳統(tǒng)BCG相比較,表現(xiàn)為Ag85B特異性IgG水平的升高,并測得IgG2b/IgG1水平也升高,顯示Thl型免疫應答增強,與細胞免疫反應結果一致。 因此,初步研究表明這兩株重組BCG有望開發(fā)成為有效的新型抗結核疫苗用于結核病的預防,為進一步的動物保護實驗等奠定了基礎。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2292115