發(fā)布時間：2018-10-20 10:47

【摘要】： 目的:臨床實踐表明應(yīng)用G-CSF作為干細(xì)胞動員劑進(jìn)行的外周血造血干細(xì)胞移植,其急性移植物抗宿主反應(yīng)并不比傳統(tǒng)的骨髓移植高。這說明G-CSF存在著誘導(dǎo)免疫耐受的作用。G-CSF可以從T細(xì)胞分化、樹突狀細(xì)胞(DCs)、單個核細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等角度對干細(xì)胞移植物的免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié),誘導(dǎo)移植物中的T細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受。目前的觀察表明,G-CSF刺激后,出現(xiàn)Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2、T-bet、IL-12等)明顯減少,而Th2型細(xì)胞因子(IL-10、IL-4、GATA-3等)顯著增多,這一現(xiàn)象在誘導(dǎo)免疫耐受中起著至關(guān)重要的作用。但是,目前對T細(xì)胞上是否存在G-CSF受體仍存在很大的爭議,因此G-CSF能否直接對T細(xì)胞產(chǎn)生作用仍不肯定。 JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑作為機(jī)體內(nèi)非常重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一,在機(jī)體免疫功能的形成與發(fā)揮作用中有重要的作用。這一途徑參與體內(nèi)多種病理生理過程,調(diào)節(jié)體內(nèi)眾多基因的表達(dá),約有50余種細(xì)胞因子通過其進(jìn)行信號傳導(dǎo)。因此,它對機(jī)體各種生理功能的維持及對外界刺激做出正確的反應(yīng)是非常重要的一環(huán)。其中,STAT1作為Th1型細(xì)胞因子重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,在IFN-γ、IL-2引起的基因轉(zhuǎn)錄過程中居于核心地位。并且很多學(xué)者已經(jīng)證實STAT1是GVHD重要的調(diào)控點。但到目前為止,尚沒有研究對STAT1在G-CSF誘導(dǎo)的免疫耐受中的變化進(jìn)行過檢測。因此本實驗在G-CSF誘導(dǎo)免疫耐受過程中,檢測Th1型細(xì)胞及Th2型細(xì)胞的數(shù)量及比值,并檢測G-CSF受體、T-bet、GATA-3和STAT1的表達(dá)水平的變化,并對其作用進(jìn)行初步探討,以進(jìn)一步加深對G-CSF誘導(dǎo)免疫耐受機(jī)制的了解、為對其進(jìn)行調(diào)控打下基礎(chǔ)。 方法: 1收集標(biāo)本:分別留取23位骨髓移植供者應(yīng)用G-CSF動員前及應(yīng)用G-CSF動員3天后的外周血標(biāo)本10ml,使用肝素抗凝。 2分組:共分為兩組,即供者應(yīng)用G-CSF動員前的外周血標(biāo)本和供者應(yīng)用G-CSF動員后的外周血標(biāo)本,為配對標(biāo)本。 3應(yīng)用免疫磁珠分選法分選CD4+T細(xì)胞:從采集的外周血標(biāo)本分離出單個核細(xì)胞后,再應(yīng)用免疫磁珠分選的方法分離CD4+T細(xì)胞并提純,最后用流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞的純度并計數(shù)。 4流式細(xì)胞技術(shù)檢測G-CSF動員前及G-CSF動員后的CD4+T細(xì)胞中Th1、Th2的數(shù)量及Th1/Th2比值。 5制備cDNA:把分選得來的CD4+T細(xì)胞應(yīng)用Trizol試劑盒提取RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 6應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time Quantitative PCR,RQ-PCR)方法分別檢測體內(nèi)應(yīng)用G-CSF動員前后G-CSFR、T-bet、GATA-3和STAT1表達(dá)量的變化。 7將純化的CD4+T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),并在培養(yǎng)過程中加入不同濃度的G-CSF刺激,觀察其刺激T細(xì)胞增殖的作用。 8分別將應(yīng)用G-CSF刺激前后培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞收集,提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA. 9 RQ-PCR方法檢測體外培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞經(jīng)G-CSF刺激前后的G-CSFR、T-bet、GATAT-3和STAT1表達(dá)量變化。 結(jié)果: 1在流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+T細(xì)胞Th1/Th2比值結(jié)果顯示G-動員后的Th1/Th2比值較動員前的Th1/Th2比值有顯著的降低。 2我們對標(biāo)本進(jìn)行CD4+T細(xì)胞計數(shù),顯示G-CSF動員3天后CD4+T細(xì)胞的數(shù)量和占單個核細(xì)胞的比例均增加。 3應(yīng)用RQ-PCR檢測體內(nèi)應(yīng)用G-CSF動員后G-CSFR、T-bet、GATA-3及STAT1表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示:雖這些基因的表達(dá)均有變化,但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理,均沒有統(tǒng)計學(xué)意義。 4體外培養(yǎng)分離純化的CD4+T淋巴細(xì)胞,結(jié)果顯示:G-CSF可以刺激分離后的CD4+T淋巴細(xì)胞增殖,這種作用達(dá)峰時間為12-24小時,48小時后開始下降,72小時后作用消失。G-CSF的刺激濃度以200ng/ml為宜,增加濃度,增殖指數(shù)未見明顯的增加。 5 RQ-PCR檢測在體外培養(yǎng)時加入G-CSF刺激前后的CD4+T細(xì)胞的G-CSFR、T-bet、GATA-3、STAT1的表達(dá)變化。結(jié)果顯示:在體外加入G-CSF刺激后,CD4+T細(xì)胞出現(xiàn)了G-CSFR和GATA-3表達(dá)的升高,T-bet和STAT1則出現(xiàn)下降。 結(jié)論: 1體內(nèi)應(yīng)用G-CSF動員后,Th1/Th2比值比動員前顯著降低(P0.01)。表明在供者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞受到G-CSF刺激后,CD4+T淋巴細(xì)胞會向Th2方向分化,這可能誘導(dǎo)了免疫耐受的產(chǎn)生。 2體內(nèi)應(yīng)用G-CSF動員后,CD4+T細(xì)胞短期內(nèi)(至少3天內(nèi))可以因G-CSF的刺激作用而出現(xiàn)增殖。 3體外培養(yǎng)分離純化的CD4+T淋巴細(xì)胞時加入G-CSF可以刺激分離后的CD4+T淋巴細(xì)胞增殖。這種作用12-24小時達(dá)到高峰,48小時后開始下降,72小時后消失。G-CSF最適刺激濃度以200ng/ml。 4體內(nèi)應(yīng)用G-CSF動員后G-CSFR的表達(dá)量未見增高,而在外培養(yǎng)CD4+T細(xì)胞并加入G-CSF刺激后會出現(xiàn)G-CSFR表達(dá)的增高,這可能與體內(nèi)、外環(huán)境的差異,以及體內(nèi)G-CSF濃度處于較低水平且濃度不穩(wěn)定有關(guān)。 5體內(nèi)應(yīng)用G-CSF動員后GATA-3及T-bet的變化趨勢不明顯。而在體外培養(yǎng)應(yīng)用G-CSF后GATA-3出現(xiàn)明顯的升高同時T-bet則明顯降低,這可能與體內(nèi)外的環(huán)境差異有關(guān)。 6 STAT1在體內(nèi)應(yīng)用G-CSF動員后并沒有減低,但在體外培養(yǎng)加入G-CSF刺激后會出現(xiàn)STAT1的減低,這可能與體內(nèi)外環(huán)境的差異、體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系和STAT1在維持Treg細(xì)胞的產(chǎn)生及發(fā)揮正常作用是必需的有關(guān)。目前關(guān)于這方面的研究較少,要明白其確切作用及機(jī)制,仍需要大量的研究。
[Abstract]:Objective: Clinical practice shows that G-CSF is used as a stem cell mobilization agent for peripheral blood stem cell transplantation, and its acute graft-versus-host response is not higher than that of conventional bone marrow transplantation. This suggests that G-CSF has the effect of inducing immune tolerance. G-CSF can regulate the immune function of stem cell grafts from T cell differentiation, dendritic cells (DCs), mononuclear cells, regulatory T cells and other angles, and induce T cells in the graft to generate immune tolerance. At present, there is a significant decrease in Th1 type cytokines (IFN-, IL-2, T-bet, IL-12, etc.) after G-CSF stimulation, while Th2 cytokines (IL-10, IL-4, GATA-3, etc.) have increased significantly, which plays an important role in inducing immune tolerance. However, there is still a great controversy on whether G-CSF receptor is present on T cells, and whether G-CSF can directly play a role in T cells is still uncertain. JAK-STAT signal transduction pathway is one of the most important signal transduction pathways in organism. It is necessary to take part in many pathophysiological processes in the body, regulate the expression of many genes in the body, and make about 50 kinds of cytokines through it Therefore, it is very heavy for the maintenance of various physiological functions of the body and the correct response to external stimuli STAT1, as an important signal transduction factor of Th1 type cytokines, resides in the transcription of the genes induced by IFN-jun and IL-2. Core status. And many scholars have confirmed STAT1 is very important However, we have not studied the changes of STAT1 in immune tolerance induced by G-CSF. Therefore, in the process of G-CSF induced immune tolerance, the number and ratio of Th1 cells and Th2 cells were detected, and the expression levels of G-CSF receptor, T-bet, GATA-3 and STAT1 were detected, and the effects of G-CSF receptor, T-bet, GATA-3 and STAT1 were investigated. The knowledge of the system is to regulate it. to lay a foundation Methods: 1 Collection of specimens: Twenty-three bone marrow transplantation donors were taken to apply G-CSF mobilization before and after mobilization of G-CSF for 3 days. Blood samples 10ml, heparin anti-coagulation. 2 groups: two groups, namely, donor application G-CSF mobilization, peripheral blood sample and donor application G-CSF mobilised peripheral blood samples, paired specimens. CD4 + T cells were sorted by immunomagnetic bead sorting: After isolated mononuclear cells were isolated from the collected peripheral blood samples, CD4 + T cells were isolated and purified by immunomagnetic beads sorting. and finally, detecting the purity of CD4 + T cells by flow cytometry and counting. CD4 + T cells in CD4 + T cells and Th1/ Th2 ratio in CD4 + T cells CD4 + T cells from CD4 + T cells were used to extract RNA and reverse transcribed into cDNA. Real-time quantitative polymerase chain reaction (RQ-PCR) was used to detect G in vivo. Changes of G-1R, T-bet, GATA-3 and STAT1 expression levels before and after CSF mobilization. 7 Purified CD4 + T Cells were cultured, and G-CSF stimulated by different concentrations were added during culture to observe the effect of stimulating T cell proliferation. Using. 8, the CD4 + T cells cultured before and after stimulation with G-CSF were collected, RNA was extracted and reverse transcribed into cDNA. in vitro culture The expression of G-1R, T-bet, GATAT-3 and STAT1 in CD4 + T cells after G-CSF stimulation was changed. 1. The Th1/ Th2 ratio of CD4 + T cells was detected by flow cytometry. The Th1/ Th2 ratio after G-mobilization was higher than that before mobilization. The ratio of h2 was significantly lower. We counted the CD4 + T cell count in the specimen to show the number of CD4 + T cells after 3 days after G-CSF mobilization. and the proportion of the individual nuclear cells increased. 3, the application of the RQ-PCR detection in vivo application G The changes of G-, R, T-bet, GATA-3 and STAT1 levels after CSF mobilization were observed. The purified CD4 + T lymphocytes showed that G-CSF could stimulate CD4 + T lymphocytes after separation. The concentration of G-CSF decreased after 48 hours, and disappeared after 72 hours. The stimulation concentration of G-CSF was 200ng/ ml. 5 RQ-PCR was used to detect the G-1R, T-be of CD4 + T cells before and after G-CSF stimulation. t,G The expression of ATA-3 and STAT1 showed that after G-CSF stimulation was added in vitro, CD4 T-bet and STAT1 showed a decrease in the expression of G-1R and GATA-3 in + T cells. After the mobilization of G-CSF in vivo, the ratio of Th1/ Th2 was significantly lower than before mobilization (P0.01). After the stimulation of G-CSF, CD4 + T lymphocytes differentiate into Th2, which may induce the production of immune tolerance. After mobilization of G-CSF in vivo, CD4 + T cells are short-term (within at least 3 days) Proliferation can occur due to stimulation of G-CSF. 3. In vitro culture and isolation of purified CD4 + T lymphocytes stimulated the proliferation of CD4 + T lymphocytes after separation. This effect reached the peak at 12-24 hours, began to decrease after 48 hours, and disappeared after 72 hours. The optimum concentration of G-CSF was 200ng/ ml. The expression level of G-CSF R after G-CSF mobilization was not increased in 4 patients. In addition to the addition of G-CSF stimulation, the expression of G-CSF R may be increased after the addition of G-CSF, which may be related to the difference in vivo and external environment, as well as in vivo G. The CSF concentration was at a low level and the concentration was not stable. The trend of GATA-3 and T-bet after G-CSF mobilization was not obvious in 5 patients. There was a significant increase in GATA-3 after G-CSF, while T-bet decreased significantly, which could be related to environmental differences outside the body.. 6 STAT1 was not reduced after G-CSF mobilization in vivo, but in the body
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：2282917