【摘要】： 漢坦病毒是脂質(zhì)被膜包裹的RNA病毒,可以持續(xù)感染嚙齒類動(dòng)物卻不使其致病,而人在吸入含有病毒的氣溶膠狀的嚙齒動(dòng)物排泄物后可以被感染,引起腎綜合征出血熱(HFRS)和肺綜合征(HPS)。目前,還沒(méi)有針對(duì)漢坦病毒感染治療的抗病毒藥物,臨床只限于對(duì)癥和支持治療。因此,尋找有效和特異的治療漢坦病毒的新方法顯得十分重要而迫切。 RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA誘導(dǎo)的序列特異性的基因沉默機(jī)制。以致病基因?yàn)榘悬c(diǎn)的RNAi技術(shù),可用于治療包括腫瘤、感染性疾病和遺傳病在內(nèi)的各種疾病�？共《綬NAi策略作為治療方法的應(yīng)用研究正備受關(guān)注,有多種基于該策略的方案正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。然而,盡管針對(duì)病毒基因的RNAi能夠特異性地抑制病毒的復(fù)制,但小RNA的組織或細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)運(yùn)卻絕非簡(jiǎn)單易行。 治療性小干擾RNAs(siRNAs)面臨著如何在體內(nèi)被特異和有效地轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞的難題。研究結(jié)果提示,體內(nèi)細(xì)胞類型特異性的基因沉默可以通過(guò)siRNA與細(xì)胞類型特異性親和配體或單克隆抗體結(jié)合而得以實(shí)現(xiàn),即抗體指導(dǎo)的siRNA復(fù)合物通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入靶細(xì)胞,隨后釋放到細(xì)胞漿,通過(guò)RNAi路徑,特異性地沉默靶基因的表達(dá)。與小分子堿性核酸結(jié)合蛋白融合的抗體片段是一種體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的有效工具,體內(nèi)基因沉默的特異性、不引發(fā)非特異性免疫激活和全身毒性等特點(diǎn)促進(jìn)了以治療性RNAi的細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)運(yùn)為基礎(chǔ)的治療方法的開(kāi)發(fā)。 本研究針對(duì)漢坦病毒76-118株的編碼基因,以隨機(jī)序列siRNA為陰性對(duì)照,設(shè)計(jì)合成了4種siRNAs,篩選出抗病毒效果最強(qiáng)的siRNA-HV2(命名為siHV)用于下一步研究。 為確定抗體介導(dǎo)的siRNA是否可以特異性地將siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)入漢坦病毒感染的細(xì)胞,在原核表達(dá)載體pET32a中表達(dá)了一種融合蛋白3G1scFv-C_K-tP,它由漢坦病毒抗原特異性單鏈抗體(3G1scFv)與魚(yú)精蛋白片段(第8-29位氨基酸)通過(guò)人C_K連接而形成。誘導(dǎo)表達(dá)的此融合蛋白以可溶性表達(dá)為主,此融合蛋白明顯保留有抗原結(jié)合活性,可以特異地結(jié)合胞膜上的病毒抗原,與細(xì)胞表面的抗原結(jié)合后可以特異性地內(nèi)化入感染細(xì)胞的胞漿,且與轉(zhuǎn)鐵蛋白有相似的內(nèi)化路徑,即通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 此融合蛋白可以結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)siRNAs到漢坦病毒感染的細(xì)胞。先后用凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明:3G1scFv-C_K-tP具有與siRNA結(jié)合的能力,且這種結(jié)合能力存在著劑量依賴關(guān)系;DynabeadsTALON磁珠分析顯示3G1scFv-C_K-tP與siRNA之間量的結(jié)合關(guān)系為1分子3G1scFv-C_K-tP可以結(jié)合約10分子siRNA;3G1scFv-C_K-tP可以將FITC-siRNA特異性地運(yùn)送到病毒感染的細(xì)胞。采用MTT方法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,表明3G1scFv-C_K-tP/siRNA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有毒性作用。 在感染細(xì)胞中,此融合蛋白靶向轉(zhuǎn)運(yùn)siHV能夠有效地抑制病毒的復(fù)制。結(jié)果表明:3G1scFv-C_K-tP/siHV降低了病毒RNA和病毒抗原的水平,而且下降程度與siRNA呈劑量依賴性。 在乳鼠顱內(nèi)注射漢坦病毒76-118株以制備動(dòng)物模型,然后腹腔注射3G1scFv-C_K-tP/FITC-siRNA混合物,證實(shí)此融合蛋白能夠特異地將siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)入漢坦病毒感染的腦細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示3G1scFv-C_K-tP可以特異性的將FITC-siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到漢坦病毒感染的腦組織,且熒光顯微鏡下可見(jiàn)熒光陽(yáng)性細(xì)胞、高倍鏡下觀察到熒光彌散分布在漢坦病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。 腹腔注射3G1scFv-C_K-tP/siHV可以用于漢坦病毒感染性腦炎的保護(hù)。結(jié)果顯示3G1scFv-C_K-tP/siHV治療組中病毒RNA和病毒抗原的水平明顯降低;將腦組織和其它組織分別進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,觀察到3G1scFv-C_K-tP/siHV使?jié)h坦病毒的感染和復(fù)制受到了明顯抑制;對(duì)動(dòng)物的生存率進(jìn)行評(píng)估,發(fā)現(xiàn)3G1scFv-C_K-tP轉(zhuǎn)運(yùn)的siHV對(duì)動(dòng)物有明顯的保護(hù)作用;檢測(cè)乳鼠體內(nèi)IFN水平,顯示3G1scFv-C_K-tP/siHV并未誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生,證明在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的保護(hù)作用是由針對(duì)病毒RNA的特異性RNAi所介導(dǎo)�？傊�,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:3G1scFv-C_K-tP可以特異性轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA,并沉默靶基因的表達(dá),因此可以用于漢坦病毒感染的保護(hù)。
[Abstract]:Hantavirus is a lipid-coated RNA virus that can be continuously infected without causing it to cause disease, whereas humans can be infected after inhalation of a virus-containing aerosol-like rodent excreta, causing hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) and lung syndrome (HPS). Currently, there are no antiviral drugs for the treatment of Hantavirus infection, which is limited to symptomatic and supportive treatment. Therefore, it is very important and urgent to find effective and specific new methods for treating Hantavirus. RNA interference (RNAi) is a sequence-specific gene sink induced by double-stranded RNA The RNAi technology, targeting pathogenic genes, can be used to treat diseases, including tumors, infectious diseases, and parasitic diseases. The application of anti-virus RNAi strategy as a treatment method is attracting more and more attention, and there are a variety of protocols based on this strategy. However, although RNAi against viral genes can specifically inhibit viral replication, tissue or cell-specific transport of small RNAs is by no means simple Single-easy. Therapeutic small interfering RNAs (siRNAs) are faced with how to be specifically and effectively transported in vivo The results suggest that in vivo cell type-specific gene silencing can be achieved by binding siRNA to cell type specific affinity ligands or monoclonal antibodies, i.e., antibody directed siRNA complexes enter the target cells by endocytic action, Over-RNAi pathway, specific sinking An antibody fragment fused with a small molecule alkaline nucleic acid binding protein is an effective tool for in vivo transport, Due to the specificity of silencing, non-specific immune activation and systemic toxicity, the specific transport of cell types with therapeutic RNAi is promoted. In this study, four siRNAs were synthesized and the strongest anti-viral siRNA-HV2 (named s) was screened. iHV) is used for the next study. To determine whether an antibody-mediated siRNA can specifically transport siRNA into Hantavirus infected cells, a fusion egg is expressed in a prokaryotic expression vector pET32a White 3G1scFv-C _ K-tP, consisting of Hantavirus antigen specific single chain antibody (3G1scFv) and protamine fragment (8th to 29th) The fusion protein is mainly expressed as soluble expression, and the fusion protein is obviously retained with antigen binding activity, can specifically bind the virus antigen on the cell membrane, and can be combined with the antigen of the cell surface and can so as to specifically internalize the cytoplasm of the infected cells and have a similar internalization path to the transferrin, i.e. This fusion protein can be combined The results showed that 3G1scFv-C _ K-tP had the ability to bind with siRNA, and the binding ability existed in dose-dependent relation; DynabeadsTAALON beads analysis showed that the binding relationship between 3G1scFv-C _ K-tP and siRNA was 1 molecule 3G1scFv-C. _ K-tP can bind about 10 molecular siRNA; 3G1scFv-C _ K-tP can bind FITC-The cell growth curve was measured by MTT assay, indicating 3G1scFv-C _ K-tP/ siRNA has no toxic effect on cell growth. In infected cells, this fusion The results showed that 3G1scFv-C _ K-tP/ siHV reduced viral RNA and virus resistance. An animal model was prepared by intraperitoneal injection of Hantavirus 76-118 strain, and then the 3G1scFv-C _ K-tP/ FITC-siRNA mixture was injected intraperitoneally to confirm the fusion. The fusion protein can specifically transport the siRNA into the brain cells infected with Hantavirus, and the flow cytometry detects that 3G1scFv-C _ K-tP can specifically transport FITC-siRNA to the brain tissue of Hantavirus infection, The fluorescence dispersion was observed in the cell membrane and cytoplasm of Hantavirus infection cells. The intraperitoneal injection of 3G1s CFv-C _ K-tP/ siHV could be used in the protection of Hantavirus infection encephalitis. The results showed that the levels of viral RNA and viral antigen in 3G1scFv-C _ K-tP/ siHV treatment group were significantly decreased, and immunohistochemical staining of brain tissue and other tissues was performed to observe 3G1scFv-C _ K-tP/ siH. V has been shown to inhibit the infection and replication of Hantavirus; assess the survival rate of animals; find that 3G1scFv-C _ K-tP trans-transporter siHV has a significant protective effect on animals; detect IFN levels in milk rats, and show that 3G1scFv-C _ K-tP/ siHV does not induce IFN production and is proved to be The protective effects produced in animals are mediated by specific RNAi targeting viral RNA. In conclusion, the results show that 3G1scFv-C _ K-tP can be specifically transported.
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R346

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王凱;溫偉紅;王濤;張瑞;秦?zé)槦?雷小英;楊安鋼;;人源抗HER2單鏈抗體/輕鏈恒定區(qū)/魚(yú)精蛋白截短體融合蛋白的基因構(gòu)建、表達(dá)及活性鑒定[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年07期

2 陳銳;楊潔;張芳琳;秦?zé)槦?王濤;張瑞;孟艷玲;胡剛;徐志凱;楊安鋼;;HV單鏈抗體/魚(yú)精蛋白片段融合蛋白1A8 ScFv/Cκ/P的構(gòu)建和表達(dá)[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年11期

3 姚培炎,朱洪生,梁保羅,王一山;魚(yú)精蛋白嚴(yán)重過(guò)敏二例[J];中國(guó)胸心血管外科臨床雜志;1998年03期

4 包豐齡;;注射魚(yú)精蛋白后的血流動(dòng)力學(xué)變化[J];國(guó)際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志;1987年05期

5 陳蘭仁,黃萍,林莉荔,劉學(xué)剛;分次小劑量魚(yú)精蛋白拮抗肝素的臨床運(yùn)用[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1998年05期

6 伍建林,譚潔芳,陳秉學(xué),張建軍;多巴胺對(duì)魚(yú)精蛋白循環(huán)抑制作用的緩解[J];臨床麻醉學(xué)雜志;1998年01期

7 張巖,鄭吉健,殷玉水,盧光臨;葡萄糖酸鈣伍用小劑量魚(yú)精蛋白減輕魚(yú)精蛋白循環(huán)抑制的作用[J];濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1999年01期

8 郝在軍,昌克勤;魚(yú)精蛋白的嚴(yán)重不良反應(yīng)—急性非心源性肺水腫[J];內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志;2001年05期

9 李曉峰;心內(nèi)直視術(shù)中魚(yú)精蛋白的毒性反應(yīng)分析[J];中國(guó)誤診學(xué)雜志;2003年05期

10 毛衛(wèi)克，劉俊杰，，王玉英;魚(yú)精蛋白拮抗肝素時(shí)循環(huán)和肺力學(xué)變化的相關(guān)因素分析[J];臨床心血管病雜志;1994年06期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 王長(zhǎng)軍;唐家琪;李先富;潘秀珍;操敏;;抗人紅細(xì)胞血型抗原噬菌體單鏈抗體的研究[A];面向21世紀(jì)的科技進(jìn)步與社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展（下冊(cè)）[C];1999年

2 王洪利;舒建昌;;單鏈抗體在肝臟疾病中應(yīng)用的研究進(jìn)展[A];廣東省肝臟病學(xué)會(huì)2007年年會(huì)論文集[C];2007年

3 孫娜娜;王欲曉;周麗君;王剛;;人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180-NC16A單鏈抗體的構(gòu)建及表達(dá)[A];2009全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

4 張惠中;;細(xì)胞內(nèi)生成的抗整合酶單鏈抗體阻斷HIV-1復(fù)制的實(shí)驗(yàn)研究[A];新世紀(jì) 新機(jī)遇 新挑戰(zhàn)——知識(shí)創(chuàng)新和高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展（上冊(cè)）[C];2001年

5 王欲曉;喬媛媛;周麗君;;人源性抗蓖麻單鏈抗體的分離純化和活性鑒定[A];第六屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

6 汪世華;胡開(kāi)輝;楊燕凌;邱君志;;基因工程單鏈抗體研究[A];2005全國(guó)第二屆核酸疫苗研討會(huì)論文集[C];2005年

7 溫偉紅;薛茜;孟艷玲;楊安鋼;;可內(nèi)化的人源性抗HBsAg單鏈抗體用于siRNA靶向輸送的研究[A];中國(guó)免疫學(xué)會(huì)第五屆全國(guó)代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2006年

8 林志偉;汪世華;王宗華;;抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單鏈抗體(DON-ScFv)在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)與分泌[A];中國(guó)生物工程學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)暨全國(guó)生物反應(yīng)器學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

9 楊燕凌;;酶(蛋白)融合技術(shù)研究[A];華東地區(qū)農(nóng)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)暨福建省科協(xié)第七屆學(xué)術(shù)年會(huì)農(nóng)業(yè)分會(huì)場(chǎng)論文集[C];2007年

10 陳立;宋今丹;;抗人大腸癌重組單鏈抗體的研制[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第七次會(huì)議論文摘要匯編[C];1999年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 記者 劉正午;魚(yú)精蛋白緊缺背后[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2011年

2 記者 任珊珊　黎蘅 伍君儀 翁淑賢 盧文潔 黃佩 通訊員 劉丹 戴麗娟 許詠怡 溫志勤 盤瑋 宋莉萍 肖金 鄧愛(ài)文 胡穎儀 胡瓊珍 張秋霞;魚(yú)精蛋白短缺“貧富不均”[N];廣州日?qǐng)?bào);2011年

3 沈瑋　王卓銘;魚(yú)精蛋白斷貨起底： 定價(jià)機(jī)制倒逼廉價(jià)藥“消失”[N];中國(guó)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2011年

4 本報(bào)記者 韓馨儀;低價(jià)薄利魚(yú)精蛋白斷貨引發(fā)廉價(jià)藥尷尬[N];中國(guó)財(cái)經(jīng)報(bào);2011年

5 李亞紅　王思海 俞麗虹 周琳;“魚(yú)精蛋白”短缺折射監(jiān)管弊端[N];國(guó)際商報(bào);2011年

6 本報(bào)記者 王有佳;魚(yú)精蛋白,上海何以不缺貨？[N];人民日?qǐng)?bào);2011年

7 本報(bào)記者 沈瑋　王卓銘;魚(yú)精蛋白斷貨起底：定價(jià)機(jī)制倒逼廉價(jià)藥“消失”[N];21世紀(jì)經(jīng)濟(jì)報(bào)道;2011年

8 吳睿鶇;魚(yú)精蛋白稀缺不能怪藥企[N];中國(guó)消費(fèi)者報(bào);2011年

9 醫(yī)生 吳帥;魚(yú)精蛋白“救命藥荒”該如何破解[N];新華每日電訊;2011年

10 記者 俞麗虹　周琳;滬全力生產(chǎn),緩解“魚(yú)精蛋白”緊張[N];新華每日電訊;2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 胡學(xué)軍;抗乙肝病毒表面抗原PreS1(20-47)單鏈抗體基因克隆及其在大腸桿菌和煙草中的表達(dá)[D];大連理工大學(xué);2002年

2 田媛;前列腺癌細(xì)胞結(jié)合單鏈抗體的篩選、表達(dá)純 化及其功能初步研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

3 李月紅;抗ICAM-1單克隆抗體與單鏈抗體的制備及其生物學(xué)特性研究[D];吉林大學(xué);2005年

4 陳德宇;前列腺素D合成酶在男性生殖中的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究[D];南京師范大學(xué);2005年

5 熊盛;重組人源抗HBsAg單鏈抗體在大腸桿菌和巴氏畢赤酵母中的表達(dá)、純化與性質(zhì)鑒定[D];華南理工大學(xué);2002年

6 邵長(zhǎng)利;抗人紅細(xì)胞單鏈抗體融合HIV-1gp41抗原肽雙功能分子的制備與鑒定[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

7 萬(wàn)忠海;抗PEA單抗和單鏈抗體制備及在綠膿感染中的應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2008年

8 楊瑞梅;單鏈抗體介導(dǎo)狂犬病毒shRNA靶向制劑的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

9 付建芳;溶藻弧菌抗獨(dú)特型抗體基因工程疫苗的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

10 余自強(qiáng);抗血小板膠原受體糖蛋白VI單克隆抗體的制備和功能研究[D];蘇州大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 徐飛虎;抗肺癌單鏈抗體偶聯(lián)綠色熒光蛋白基因的構(gòu)建及表達(dá)研究[D];浙江大學(xué);2003年

2 趙蕾;抗雞傳染性支氣管炎病毒單鏈抗體原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其間接ELISA篩選方法的建立[D];上海交通大學(xué);2011年

3 張薇;抗T-2毒素單鏈抗體的制備及該毒素對(duì)細(xì)胞毒性影響的初步研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2010年

4 王溪橋;大容量人源肝癌核糖體展示單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建[D];蘭州大學(xué);2010年

5 江淼;抗活化血小板表面受體全套單鏈抗體噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建和篩選[D];蘇州大學(xué);2003年

6 陳銳;抗?jié)h坦病毒單鏈抗體/Cκ/protamine截短體融合蛋白的基因構(gòu)建、表達(dá)及功能研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

7 紀(jì)秋野;抗蓖麻毒素單鏈抗體的構(gòu)建、表達(dá)、純化及功能測(cè)定[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2010年

8 張慶麗;抗EGFRvⅢ特異性單鏈抗體的構(gòu)建及其靶向性研究[D];南華大學(xué);2011年

9 劉曉雷;抗伏馬菌素B_1單鏈抗體的制備[D];福建農(nóng)林大學(xué);2010年

10 于穎;PRRSV GP5蛋白抗獨(dú)特型單鏈抗體的構(gòu)建表達(dá)與鑒定[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2282412