【摘要】： 目的: 了解安徽省產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶大腸埃希菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況,耐藥基因型別的分布,指導(dǎo)臨床合理用藥。 了解新酶的生化特性,等電點(diǎn)和酶對(duì)抗菌藥物的水解特性。了解產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶大腸埃希菌Ⅰ類整合子的流行情況,以及Ⅰ類整合子中基因盒的種類。 材料與方法: 安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)中心收集35所醫(yī)院2007年隨機(jī)月份住院和門(mén)診患者的各種臨床送檢標(biāo)本,無(wú)重復(fù)分離的E.coli共355株。全部菌株均由Microscan WalkAway-40全自動(dòng)微生物分析儀(美國(guó)DADE公司)自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定。 355株大腸埃希菌通過(guò)頭孢西丁三維實(shí)驗(yàn)篩選出確證高產(chǎn)AmpC酶菌株,以三維試驗(yàn)陽(yáng)性菌株總DNA為模板,使用blaampC通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以篩選出攜帶ampC基因菌株;將三維試驗(yàn)陽(yáng)性菌株行轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn),行全編碼引物PCR擴(kuò)增。并用瓊脂平板稀釋法測(cè)定其對(duì)13種抗菌藥物的耐藥性。 對(duì)多次測(cè)序并經(jīng)GenBank比對(duì)后確定的產(chǎn)新酶菌株進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):PCR擴(kuò)增臨床分離株和/或轉(zhuǎn)移接合子中的AmpC型β-內(nèi)酰胺酶編碼基因片段,PCR產(chǎn)物純化后克隆入pMD-18T載體,表達(dá)于感受態(tài)細(xì)胞大腸埃希菌JM109中,再次測(cè)定核苷酸序列,結(jié)果至GenBank比對(duì),進(jìn)行DNA序列分析。將新酶全編碼基因克隆入表達(dá)載體pHSG398,轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞大腸埃希菌JM109中,用加有抗菌藥物的瓊脂平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化株篩選。用瓊脂倍比稀釋法測(cè)定臨床分離株和接合子,轉(zhuǎn)化株的MIC。 采用超聲破碎法進(jìn)行產(chǎn)新酶細(xì)菌轉(zhuǎn)化株的粗酶提取,進(jìn)行酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究,以初步了解新酶的動(dòng)力學(xué)特性。等電聚焦電泳測(cè)定其等電點(diǎn)(pI)。Southern blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步了解新酶是否為質(zhì)粒介導(dǎo)。PCR篩選Ⅰ類整合酶基因,進(jìn)一步檢測(cè)陽(yáng)性樣本可變區(qū)基因盒序列。檢測(cè)攜帶新型AmpC型酶菌株的整合子基因盒。結(jié)果: 355株大腸埃希菌中21株大腸埃希菌三維實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性,占所有臨床分離菌株的5.9%(21/355),19株經(jīng)PCR檢測(cè)攜帶ampC基因,16株轉(zhuǎn)移接合成功,經(jīng)序列分析表明,9株CIT陽(yáng)性結(jié)果,6株DHA陽(yáng)性結(jié)果,3株EBC陽(yáng)性結(jié)果;1株同時(shí)攜帶EBC及DHA。檢出一株EBC型新基因(序列號(hào)為FJ237369);藥敏結(jié)果顯示臨床分離菌株及接合子對(duì)多種抗菌藥物耐藥,對(duì)頭孢吡肟,亞胺培南,美羅培南敏感。產(chǎn)新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶菌株的轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)和克隆表達(dá)試驗(yàn)均取得成功,其野生株及轉(zhuǎn)化株的MIC結(jié)果顯示:野生株和轉(zhuǎn)化株有著幾乎相同的耐藥譜,但轉(zhuǎn)化株對(duì)抗菌藥物的耐藥性有所下降。 產(chǎn)新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶細(xì)菌轉(zhuǎn)化株的等電聚焦顯示,其等電點(diǎn)在8.6左右,Southern blot實(shí)驗(yàn)提示新酶為質(zhì)粒介導(dǎo)。 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究,初步了解新酶對(duì)5種常用抗菌藥物的Km值和Vmax值,結(jié)果顯示:該酶對(duì)頭孢西丁的水解效率最高。 產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的大腸埃希菌中16株攜帶有I類整合子, 14株擴(kuò)增出了可變區(qū),經(jīng)測(cè)序基因盒為編碼磺胺類抗菌藥物耐藥的基因dhfrA17和編碼氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的基因aadA5, aadA1,aadB。ampC基因不在Ⅰ類整合子基因盒上。 結(jié)論: 根據(jù)體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷,臨床可選用第四代頭孢菌素類抗菌藥物,碳青酶烯類抗菌藥物抗感染治療。2007年安徽地區(qū)大腸埃希菌產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶以CIT型和DHA型為主,另外,我們?cè)谑澜缟鲜状螆?bào)道了一種新酶ACT-5(FJ237369)。產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌中I類整合子檢出率高,基因盒為編碼磺胺類和氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的基因。臨床應(yīng)加強(qiáng)抗菌藥物的合理應(yīng)用,以有效預(yù)防耐藥菌株的產(chǎn)生及傳播。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2278994