【摘要】： 1、人源磷酸核糖焦磷酸合成酶(hPRS1)致病突變蛋白和hPRS2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究 人源5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶(hPRS, E.C. 2.7.6.1)催化5磷酸核糖(R5P)和三磷酸腺苷酸(ATP)反應(yīng)生成腺苷酸(AMP)和5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP),是體內(nèi)嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸代謝的重要調(diào)節(jié)酶。人類的prs基因編碼三種hPRS蛋白:hPRS1、hPRS2和hPRS3。至今已有7例在原發(fā)性痛風(fēng)病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的hPRS1蛋白點(diǎn)突變,且均發(fā)現(xiàn)突變導(dǎo)致的酶活性上升是痛風(fēng)的發(fā)病原因。hPRS1的晶體結(jié)構(gòu)已被人發(fā)表,但其突變體導(dǎo)致活性升高的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)研究尚空缺。hPRS2與hPRS1一樣在所有組織都有表達(dá),目前未有研究發(fā)現(xiàn)hPRS2與痛風(fēng)發(fā)病的關(guān)系,它如何影響PRS在胞內(nèi)活性的有待研究。本研究完成了重組hPRS1蛋白,7個(gè)hPRS1點(diǎn)突變蛋白及hPRS2蛋白的表達(dá)和純化。在分子篩過程中發(fā)現(xiàn)目的蛋白存在多種聚集狀態(tài),故通過動(dòng)態(tài)光散射和沉降系數(shù)分析等實(shí)驗(yàn)檢測各蛋白的聚集狀態(tài)及其在添加底物后的聚集態(tài)的變化情況。同時(shí)應(yīng)用圓二色譜分析了hPRS1蛋白和2個(gè)hPRS1點(diǎn)突變蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和底物、抑制劑對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化等。此外酶活性測定發(fā)現(xiàn)hPRS1點(diǎn)突變蛋白比活性略高于母體蛋白,而hPRS2與hPRS1混合后蛋白比酶活性比二者單獨(dú)的都低。在以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,通過分析母體蛋白的晶體結(jié)構(gòu),提出了關(guān)于其中兩個(gè)hPRS1突變體蛋白的可能的結(jié)構(gòu)變化以及該種變構(gòu)如何影響蛋白活性的機(jī)理。hPRS1突變體蛋白及hPRS2的晶體生長仍在進(jìn)行中,部分已得到針晶在優(yōu)化篩選中�！　　　� 2、人黑色素瘤分化相關(guān)抗原5(MDA5)各功能片段的表達(dá)、純化和初步晶體學(xué)研究　　 黑色素瘤細(xì)胞分化相關(guān)抗原5(MDA5)是天然免疫系統(tǒng)中近幾年才被發(fā)現(xiàn)的重要模式識(shí)別受體,　能夠在細(xì)胞胞漿內(nèi)特異性識(shí)別一些特定RNA　病毒的RNA,通過不依賴于TLR3　的方式誘導(dǎo)Ⅰ型IFNs,從而誘導(dǎo)具有抗病毒作用的1型干擾素的生成�！DA5具有N　端2個(gè)激活下游蛋白的CARD(Caspase　recruitment　domain)結(jié)構(gòu)域,dsRNA　結(jié)合的DExD/H　box　RNA　解旋酶結(jié)構(gòu)域(Helicase　Domain)及C端的自身抑制結(jié)構(gòu)域(Self-repression　Domain)。病毒的雙鏈RNA被Helicase結(jié)構(gòu)域識(shí)別后,蛋白發(fā)生變構(gòu)暴露CARD結(jié)構(gòu)域,通過激活病毒誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(Virus-induced　signaling　adaptor)傳導(dǎo)信號(hào)。最近MDA5非常受關(guān)注,但其結(jié)構(gòu)學(xué)研究尚不完善。本研究以進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)解析的研究以及免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)為目的,開展了對(duì)MDA5各功能結(jié)構(gòu)域的蛋白片段的質(zhì)粒構(gòu)建、表達(dá)和純化工作。總共嘗試了10個(gè)重組蛋白片段的E.coli表達(dá),其中8個(gè)蛋白沒有表達(dá),有2個(gè)蛋白表達(dá)為包涵體,其中的一個(gè)片段Helicase　ATP　Binding　Domain通過變復(fù)性獲得少量蛋白,但穩(wěn)定性較差,后經(jīng)過序列改造后該片段在上清中有少量表達(dá),經(jīng)過純化純度達(dá)到95%以上。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該蛋白因二硫鍵引起的聚集嚴(yán)重,因而穩(wěn)定性較差,對(duì)于它的晶體生長工作仍在進(jìn)行中�！　�
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R589.7;R392

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本文編號(hào)：2271927