【摘要】： 目的: 摸索人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord blood mesenchymal stemcells,UCB-MSCs)的培養(yǎng)條件,探討來源于人臍血的間充質(zhì)干細(xì)胞局部定位注射治療大鼠缺血缺氧腦損傷的可行性及治療效果。 方法: 1取新生兒新鮮臍帶血48例,其中來源于早產(chǎn)兒的20例,足月兒的28例,分為早產(chǎn)組和足月組; 2每例樣本分為2份,分別采用普通培養(yǎng)基和特殊培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng): 3 48例樣本里,有8例樣本采血量5ml,20例樣本采血量10ml,20例樣本采血量20ml,每例分為兩份,分別用普通培養(yǎng)基和特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)。比較采血量、胎齡、培養(yǎng)基幾個因素對UCB-MSCs生長的影響。 4統(tǒng)計分析:將所得數(shù)據(jù)輸入SPSS11.5軟件進(jìn)行分析,樣本采血量和不同胎齡所得數(shù)據(jù)采用分層資料的X~2檢驗,培養(yǎng)基因素所得數(shù)據(jù)采用兩配對樣本X~2檢驗,比較幾個不同因素對細(xì)胞的生長有無影響,P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 5采用200g左右的雄性SD大鼠54只,制作大鼠局部腦缺血缺氧模型。過程:結(jié)扎右側(cè)頸總動脈(common carotid artery,CCA)、頸外動脈(external carotidartery,ECA),微動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈(internal carotid artery,ICA),經(jīng)CCA、ICA插入直徑0.24mm的魚線,至距離剪口處約2.0cm,至大腦中動脈(middle cerebral artery,MCA)分支處,即阻斷ACA血流,缺血2h后拔出魚線實現(xiàn)再灌流。將建模成功后的大鼠模型分為試驗組和對照組,于模型建立后第1天按照Zea Longa等的神經(jīng)缺損評分標(biāo)準(zhǔn)對2組模型進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn):0分:無神經(jīng)缺損癥狀;1分:不能完全伸展對側(cè)前爪;2分:向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向?qū)?cè);4分:不能自發(fā)行走,意識喪失。 6建模成功后第7天,將培養(yǎng)成熟的經(jīng)DAPI標(biāo)記的UCB-MSCs經(jīng)顱內(nèi)定位注射的方法移植入模型鼠腦內(nèi),注射部位在缺血對側(cè)側(cè)腦室處(前囟旁開1.5mm,后1mm),注射量為1×10~6/μl的UCB-MSCs懸液5μl,對照組注射等量的生理鹽水。 7對比移植前實驗組和對照組神經(jīng)缺損評分,移植治療后28天試驗組和對照組神經(jīng)缺損評分。 8觀察比較兩組動物行為改變,(1)水迷宮實驗:選擇直徑為1m的圓桶,桶內(nèi)水深為62cm,將圓桶平均分成4個象限。桶內(nèi)設(shè)有一直徑為6cm高為60cm的圓柱狀有機(jī)玻璃站臺,水中混入面粉制成不透明的混懸液。首先將站臺設(shè)在第一象限,開始訓(xùn)練。將大鼠每天分別從第一至第四象限入水訓(xùn)練4次,記錄每次大鼠登上站臺的時間,若大鼠60s仍未登上站臺將其捉上站臺停留10s。每次訓(xùn)練間隔時間為30～60s,連續(xù)訓(xùn)練6d。第7d將站臺轉(zhuǎn)移至其它象限,記錄大鼠分別從第1至第4象限入水后登上站臺的時間和其在第l象限的逗留時間及運動軌跡。(2)曠場實驗:裝置為36cm×36cm×36cm無頂方盒,箱底用墨線等分成9個小方格,將大鼠置于中央小方格內(nèi),觀察30s內(nèi)活動情況。計分標(biāo)準(zhǔn):大鼠1/2以上身體從所在方格進(jìn)入相臨方格計1分,大鼠后肢站立計1分,兩者相加為其總分。 9統(tǒng)計分析:所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±S)表示,輸入SPSS11.5軟件進(jìn)行分析,迷宮實驗和曠場實驗結(jié)果采用兩樣本t檢驗,比較細(xì)胞移植治療對動物行為的改善,P＜0.05為有統(tǒng)計意義;神經(jīng)缺損1天和神經(jīng)缺損28天所得數(shù)據(jù)采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗,分別比較實驗組和對照組中神經(jīng)缺損1天和28天的分值,P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 10免疫組化:行為學(xué)實驗后處死大鼠,一部分樣本直接進(jìn)行DAPI熒光陽性檢測,另選取部分樣本固定切片后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)稀釋后的兔抗MAP2一抗滴加在其上,置于染色盒中保持一定的濕度,37℃作用30分鐘。然后用0.01mol/lpH7.2PBS洗兩次,10min,用吸水紙吸去或吹干余留的液體,再滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體,同上步驟,染色30min,37℃,緩沖鹽水洗兩次10min,激光共聚焦顯微鏡下觀察照相。 結(jié)果: 1不同采血量的比較:48例樣本里,有8例樣本采血量5ml,20例樣本采血量10ml,20例樣本采血量20ml,每例分為兩份,分別用普通培養(yǎng)基和特殊培養(yǎng)基培養(yǎng),這樣共96份臍血樣本,其中16份臍血量2.5ml,40份樣本臍血量5ml,40份樣本臍血量10ml。其中16份2.5ml的臍血樣本培養(yǎng)3天后均未出現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞,5ml和10ml的樣本組80份培養(yǎng)3天后均出現(xiàn)不同程度的貼壁現(xiàn)象,20例5ml樣本組,最終普通培養(yǎng)基組只有2例成功培養(yǎng)出傳代細(xì)胞,特殊培養(yǎng)基組有5例,20例10ml樣本組,普通培養(yǎng)基組最終有5例培養(yǎng)成功,特殊培養(yǎng)基組中有7例成功。貼壁細(xì)胞主要有兩種形態(tài),小圓形細(xì)胞和短梭形細(xì)胞。分層資料X~2結(jié)果示P值均大于0.05(普通培養(yǎng)及和特殊培養(yǎng)基的P值分別為0.407、0.731),說明不管普通培養(yǎng)基組還是特殊培養(yǎng)基組,5ml樣本量和10ml樣本量對細(xì)胞培養(yǎng)成功率無影響。而2.5ml組的樣本量細(xì)胞過少,難以維持細(xì)胞生長所需的體系。 2不同胎齡的比較:采臍血樣本共48例,其中來自早產(chǎn)兒的有20例,足月兒的有28例,每例分為2份,分別用普通培養(yǎng)基和特殊培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),最終有29例樣本在兩種培養(yǎng)基下均無貼壁細(xì)胞出現(xiàn),其中早產(chǎn)樣本10例,足月樣本19例,剩余樣本均于原代培養(yǎng)2天左右出現(xiàn)貼壁細(xì)胞,普通培養(yǎng)基組有7例培養(yǎng)成功,其中早產(chǎn)臍血6例,特殊培養(yǎng)基組有17例培養(yǎng)成功,其中早產(chǎn)臍血有12例。得到的間充質(zhì)干細(xì)胞,呈典型的梭形,形態(tài)與骨髓間充質(zhì)細(xì)胞相似,體積略瘦小。隨培養(yǎng)時間延長,細(xì)胞體積逐漸增大伸展。其余得到的為異質(zhì)性貼壁細(xì)胞,細(xì)胞不均一,形態(tài)多樣。有的呈小圓形、不規(guī)則形,有的呈短梭形、大圓形細(xì)胞:有的呈荷包蛋樣;有的呈星形;有的體積巨大多個核。分層資料X~2結(jié)果示普通培養(yǎng)基組和特殊培養(yǎng)基組P值均小于0.05(P值分別為0.016、0.001),說明胎齡是影響細(xì)胞生長、培養(yǎng)成功的一個因素。 3不同培養(yǎng)基的比較:48例樣本中,普通培養(yǎng)基和特殊培養(yǎng)基均培養(yǎng)成功的有5例,特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)成功的有17例,普通培養(yǎng)基培養(yǎng)成功的有7例,最終得到均一的間充質(zhì)干細(xì)胞,傳1～2代以后才可以純化。配對樣本x~2檢驗結(jié)果得P＞0.05(P=0.08),說明兩種培養(yǎng)基對細(xì)胞的影響無顯著性差異。 4臍血間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志的測定臍血間充質(zhì)樣干細(xì)胞不表達(dá)造血標(biāo)志CD34、CD45,不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的CD106標(biāo)志,強(qiáng)烈表達(dá)與CD105、CD29等表面標(biāo)識,和檢測的骨髓結(jié)果相似,這表明MSC是區(qū)別于臍血中造血細(xì)胞的另一類細(xì)胞。 5行為學(xué)檢查:制作CMAO模型54只,成功38只,將受試大鼠分為實驗組和對照組,其中實驗組例數(shù)20只,對照組例數(shù)18只,實驗組中細(xì)胞移植后有2只大鼠死亡,最終有18只動物接受了所有的行為學(xué)實驗,對照組中有1只死亡,17只大鼠接受了所有的行為學(xué)實驗。 (1)水迷宮的實驗結(jié)果:實驗組登上站臺的平均時間為22.33s,對照組為30.18s,P＜0.01(P=0.000),差異顯著。對照組有2只大鼠從訓(xùn)練日開始至實驗結(jié)束始終繞著圓桶周邊運動,沒有一次登上站臺。 (2)曠場實驗結(jié)果:實驗組平均得分1.06分,對照組平均得分1.35分,兩者比較無顯著性差異(P=0.354)。 6神經(jīng)缺損評分:局灶性腦缺血后1d,實驗組和對照組大鼠評分分別為:3.00和3.18,兩者比較無顯著性意義(P=0.256),移植后28d實驗組和對照組大鼠神經(jīng)缺損評分分別為0.75、1.47,P＜0.05(P=0.002),差異顯著。 7組織學(xué)檢查:大腦中動脈阻塞后,最嚴(yán)重的缺血部位是尾狀核的外側(cè)和同側(cè)的皮質(zhì),嚴(yán)重的病例甚至相鄰的皮質(zhì)完全消失。移植組和對照組的腦損傷的范圍和部位在外觀上沒有明顯區(qū)別。移植了神經(jīng)干細(xì)胞的大鼠在移植部位發(fā)現(xiàn)了DAPI染色陽性的細(xì)胞,細(xì)胞分布彌散,沒有明顯聚集的特征,局部亦無腫瘤形成。對照組中的腦內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)DAPI陽性的細(xì)胞。DAPI和MAP2雙熒光染色可在移植細(xì)胞鼠腦切片內(nèi)看到藍(lán)色的核及藍(lán)綠色的胞漿。 結(jié)論: 臍血干細(xì)胞培養(yǎng)過程中,臍血的樣本量、胎齡、培養(yǎng)基的質(zhì)量對其的成活、生長有關(guān)鍵作用。5ml樣品組和10ml樣品組不管是用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)還是用特殊培養(yǎng)基,兩組細(xì)胞的培養(yǎng)成功率在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異,說明5ml-10ml的樣本量均有利于臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng),可能是這兩組的細(xì)胞密度適宜于維持細(xì)胞生長的體系。2.5ml的樣本量則不具備此條件。統(tǒng)計學(xué)上提示早產(chǎn)病例較足月病例臍血培養(yǎng)出MSCs細(xì)胞的概率要大,說明胎齡是影響臍血間充質(zhì)細(xì)胞的一個因素。普通培養(yǎng)基和特殊培養(yǎng)基對臍血間充質(zhì)細(xì)胞的影響在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異,但實驗過程中發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞不斷的分裂生長過程中,特殊培養(yǎng)基中的細(xì)胞增殖比較旺盛,培養(yǎng)出的細(xì)胞也更為單一。用人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠腦損傷,移植后28天實驗組腦組織仍可見DAPI熒光染色陽性細(xì)胞,說明移植細(xì)胞能在HIBD大鼠腦內(nèi)存活,實驗組中DAPI和FITC雙熒光均陽性,提示體外培養(yǎng)的UCB-MSCs在體內(nèi)可能通過誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮作用。實驗組動物較對照組動物的學(xué)習(xí)能力有所改善,用人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞治療腦損傷還是有一定療效的。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 侯玲玲,曹華,魏國榮,白慈賢,張涌,吳祖澤,裴雪濤;人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增和向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的研究[J];中華血液學(xué)雜志;2002年08期

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本文編號：2271735