【摘要】： 前言 在現(xiàn)代社會(huì)不育癥已成為僅次于腫瘤和心腦血管疾病的第三大疾病,生殖健康逐漸引起人們的普遍重視。目前,全球大約有15%的夫婦受到不育癥的困擾,導(dǎo)致男性不育最主要的原因是由精子生成障礙引起的。為了從根本上實(shí)現(xiàn)對(duì)男性不育的診療,需要對(duì)精子的發(fā)生過程和機(jī)制有更深入的研究。精子發(fā)生是一個(gè)非常復(fù)雜的生理過程,并且在這個(gè)過程中存在許多睪丸特異性的基因表達(dá),由此產(chǎn)生一些酶類和蛋白質(zhì)來調(diào)節(jié)精子的發(fā)生。許多睪丸特異性基因具有發(fā)育階段特異性和組織細(xì)胞特異性等表達(dá)特征,這些特異性基因參與精子發(fā)生過程中特異的細(xì)胞活動(dòng),如減數(shù)分裂、遺傳物質(zhì)重組和染色質(zhì)的濃縮以及發(fā)育后期的變態(tài)過程。當(dāng)睪丸特異基因出現(xiàn)異常會(huì)導(dǎo)致少精、弱精或精子畸形等現(xiàn)象發(fā)生。 Fankl基因是我們實(shí)驗(yàn)室最新篩查到的一個(gè)睪丸特異表達(dá)基因,該基因位于7號(hào)染色體,是由FnⅢ結(jié)構(gòu)域和5個(gè)錨定蛋白組成的,編碼一種核蛋白,該蛋白是一種睪丸組織特異轉(zhuǎn)錄因子。并且Fankl基因在11種脊椎動(dòng)物中高度保守,其中小鼠和人的Fankl基因同源性高達(dá)85%,說明該基因在精子發(fā)生過程中具有重要的生理作用。Fankl基因在精子發(fā)生過程的減數(shù)分裂到單倍體階段廣泛表達(dá),研究其特性和功能對(duì)揭示精子發(fā)生的內(nèi)在機(jī)理、防治由精子發(fā)生異常引起的男性不育及開發(fā)避孕藥物等方面有重要意義。因此通過RNA干擾的方法建立Fankl基因敲減轉(zhuǎn)基因小鼠不育模型,并對(duì)基因敲減小鼠模型進(jìn)行傳代功能分析和表型分析,來進(jìn)一步研究Fankl基因在精子發(fā)生過程中的功能及其在男性不育中的作用及意義。 材料與方法 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、人胚腎細(xì)胞系293T 2、SPF級(jí)C57BL／6小鼠、B6D2F1小鼠和ICR小鼠 3、細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑 4、分子克隆及PCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑 5、RT-PCR、Real-time PCR和microRNA提取等相關(guān)試劑 6、Southern blot、Western blot等相關(guān)試劑 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、Fankl干擾載體的構(gòu)建及在細(xì)胞水平的鑒定 (1)pSUPER-shFankl重組質(zhì)粒的構(gòu)建和]pDsRed-Fankl融合表達(dá)構(gòu)件的制備 根據(jù)Fankl基因cDNA序列,應(yīng)用http://www.dharmacon.com/在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)2條干擾序列,分別克隆至帶有H1啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體pSUPER-neo-GFP中，同時(shí)從成年C57BL／6小鼠睪丸組織擴(kuò)增Fankl基因全序列,構(gòu)建Fank1基因與紅色熒光蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒pDsRed-Fank1。 (2)將上述兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,分別應(yīng)用熒光檢測(cè)、RT-PCR和Western blot等方法檢測(cè)Fankl干擾載體干擾效率。 2、Fankl基因敲減小鼠模型的建立 (1)選取干擾效率高的siRNA表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)單酶切后,采用凝膠純化試劑盒純化,通過顯微注射的方法注射到BDF1小鼠受精卵中,將注射基因的受精卵移植到假孕母鼠輸卵管內(nèi),利用PCR和Southern blot方法對(duì)仔鼠進(jìn)行檢測(cè)。 (2) Fankl基因敲減轉(zhuǎn)基因小鼠繁育。 3、Fankl基因敲減轉(zhuǎn)基因小鼠表型分析 (1)提取Fankl基因敲減轉(zhuǎn)基因小鼠睪丸組織microRNA,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Fankl siRNA在基因敲減轉(zhuǎn)基因小鼠睪丸組織的表達(dá)情況。(2)通過RT-PCR、Real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)Fankl基因在基因 敲減小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況。(3)對(duì)Fankl基因敲減轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的睪丸重量、精子的數(shù)量進(jìn) 行比較和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；(4) Fankl基因敲減轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠交配,比較產(chǎn)仔數(shù)量及產(chǎn)仔周期 并進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 1、經(jīng)PCR檢測(cè)鑒定含干擾序列的重組質(zhì)粒pSUPER-shFankl 631#, pUPER-shFankl 247#及pDsRed-Fankl表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,測(cè)序結(jié)果完全正確。 2、轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞36h后,熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)shFank1631#、247#均能明顯抑制紅色熒光蛋白表達(dá),抑制效率分別為95%和90%,RT-PCR和’Western blot結(jié)果表明Fankl基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都受到顯著抑制(p0.05)。 3、利用顯微注射法將pSUPER-shFank1 631#注入BDF1小鼠受精卵原核中,共注射285枚胚胎,存活203枚,將注射后存活的受精卵分別移植到8只ICR假孕雌鼠輸卵管內(nèi),共產(chǎn)仔53只,經(jīng)PCR及Southern blot檢測(cè)后共14只陽(yáng)性小鼠,陽(yáng)性率為26.4%。 4、Fankl siRNA在基因敲減小鼠睪丸組織中均特異表達(dá)。采用半定量RT-PCR檢測(cè)基因敲減小鼠睪丸組織Fankl mRNA表達(dá)與正常小鼠相比明顯降低。在RT-PCR的基礎(chǔ)上,又采用Real Time-PCR和Western blot的方法檢測(cè)Fankl基因在基因敲減小鼠的表達(dá)。結(jié)果顯示基因敲減小鼠的Fankl基因表達(dá)量與野生型小鼠比較都有不同程度的降低,其中F01、F02、Fo11、F045 Founder轉(zhuǎn)基因小鼠Fankl基因表達(dá)明顯下調(diào)。 5、成年Fankl基因敲減雄性小鼠睪丸組織重量和野生型雄性小鼠睪丸組織重量進(jìn)行比較,無顯著性差異(p0.05)。 6、經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,Fankl基因敲減小鼠精子數(shù)量、產(chǎn)仔周期和產(chǎn)仔數(shù)量與野生型比較均有顯著性差異,p0.05。 結(jié)論 1、成功構(gòu)建小鼠睪丸特異基因Fankl干擾載體和pDsRed-Fank1融合表達(dá)載體。經(jīng)體外細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證Fankl干擾載體能產(chǎn)生干擾效應(yīng)。 2、成功建立Fankl基因敲減轉(zhuǎn)基因小鼠模型。 3、Fankl是精子發(fā)生過程中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,轉(zhuǎn)基因小鼠Fankl基因表達(dá)抑制,可導(dǎo)致精子生成障礙。
[Abstract]:Foreword In modern society, infertility has become the third major disease next to tumor and cardiovascular and cerebrovascular diseases, and reproductive health gradually causes people At present, about 15% of couples worldwide suffer from infertility, leading to male infertility, mainly due to sperm production barrier In order to fundamentally realize the diagnosis and treatment of male infertility, it is necessary to have a deeper understanding of the process and mechanism of sperm production Study. Spermatogenesis is a very complex physiological process, and there are many testis-specific gene expression in this process, thereby producing enzymes and proteins to modulate sperm Many testis-specific genes have specific expression characteristics such as developmental stage specificity and histiocytic specificity. These specific genes are involved in specific cellular activities in spermatogenesis, such as meiosis, recombination of genetic material, concentration of chromatin, and later development. The abnormal process. When testis specific gene abnormality can lead to oligospermia, weak sperm or sperm malformation, etc. The Fankl gene is a newly-screened testis-specific expression gene in our laboratory. The gene is located on chromosome 7. It is composed of fibronectin type 鈪，

本文編號(hào)：2266837