【摘要】： 目的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)可被誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞,被認(rèn)為是組織工程種子細(xì)胞的重要來(lái)源。在體外培養(yǎng)時(shí),hBMSCs壽命有限,隨傳代次數(shù)增加其分化能力逐漸喪失,這限制了其在組織工程中的研究和運(yùn)用。轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅速發(fā)展,使永生化細(xì)胞建立成為可能。本研究通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將外源人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因轉(zhuǎn)入人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中,以建立永生化的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 方法通過(guò)脂質(zhì)體將含有hTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pLEGFP-C1-hTERT)轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞PT67,G418篩選出表達(dá)病毒的陽(yáng)性細(xì)胞克隆。選取3個(gè)細(xì)胞克隆,各自進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。通過(guò)NIH 3T3對(duì)選取細(xì)胞的上清進(jìn)行病毒滴度測(cè)定,確定最高病毒滴度。提取并擴(kuò)增hBMSCs,用病毒滴度最高的上清感染第三代(P3)hBMSCs。G418篩選感染后的細(xì)胞,選取3個(gè)單克隆分別進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。通過(guò)RT-PCR和Western Blot測(cè)定hTERT基因是否轉(zhuǎn)入hBMSCs中并表達(dá)。對(duì)P3轉(zhuǎn)導(dǎo)后的hBMSCs(hTERT-hBMSCs)在形態(tài)學(xué),細(xì)胞表型,向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)方面研究證明hTERT-hBMSCs仍保持轉(zhuǎn)導(dǎo)前的特性。通過(guò)MTT法測(cè)繪轉(zhuǎn)導(dǎo)前后hBMSCs生長(zhǎng)曲線,觀察hTERT基因轉(zhuǎn)入后對(duì)細(xì)胞增殖的影響。通過(guò)TRAP-ELISA對(duì)hTERT-hBMSCs中端粒酶活性進(jìn)行檢測(cè);通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)對(duì)hTERT-hBMSCs致瘤性方面進(jìn)行研究。 結(jié)果通過(guò)RT-PCR和Western Blot檢測(cè),轉(zhuǎn)導(dǎo)后hBMSC中有hTERT基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá),而未轉(zhuǎn)導(dǎo)hBMSC中雖可測(cè)到hTERT基因弱的mRNA轉(zhuǎn)錄,但是沒(méi)有測(cè)到蛋白的翻譯。hTERT-hBMSCs在形態(tài)學(xué)上和hBMSC一樣呈長(zhǎng)梭形,但是由于轉(zhuǎn)導(dǎo)有EGFP基因,前者有綠色熒光蛋白表達(dá)。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)前后hBMSC表面抗原標(biāo)記:CD29,CD71,CD106,CD45和CD34,結(jié)果為前三項(xiàng)抗原都是陽(yáng)性,后兩項(xiàng)為陰性。在功能學(xué)方面,通過(guò)向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo),免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)到轉(zhuǎn)導(dǎo)前后的細(xì)胞都呈棕黃色,說(shuō)明有軟骨細(xì)胞特異性標(biāo)記II型膠原蛋白表達(dá)。TRAP-ELISA檢測(cè)到hTERT-hBMSCs中端粒酶活性,而沒(méi)有測(cè)到未轉(zhuǎn)導(dǎo)hBMSC中端粒酶活性。hTERT-hBMSCs增殖能力增加,現(xiàn)其傳代數(shù)在50代以上。在體外平板克隆培養(yǎng)中,hTERT-hBMSCs和hBMSCs細(xì)胞克隆形成不僅數(shù)量少,而且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差,克隆形成率為0.83%和0.67%,低于正常細(xì)胞克隆形成率1%,而對(duì)照組惡性黑色素瘤細(xì)胞克隆數(shù)量多,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好,克隆形成率為57.4%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腫瘤細(xì)胞克隆形成率10%。在裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)中,陽(yáng)性對(duì)照惡性黑色素瘤細(xì)胞接種于裸鼠背部皮下,三周后局部就形成的腫塊,HE染色為惡性黑色素瘤細(xì)胞,而注射有hTERT-hBMSCs的部位觀察兩月未見(jiàn)腫物形成,局部皮下組織HE染色為皮下疏松結(jié)締組織。 結(jié)論hTERT基因成功導(dǎo)入hBMSCs后不改變hBMSCs細(xì)胞形態(tài),表面標(biāo)記和分化功能,保持其向軟骨細(xì)胞分化的能力。hTERT基因轉(zhuǎn)入使hBMSCs端粒酶活性被激活,其細(xì)胞壽命延長(zhǎng)。hTERT基因轉(zhuǎn)入使hBMSCs沒(méi)有向惡性轉(zhuǎn)化。研究證明成功地建立功能正常的永生化hBMSCs,可為組織工程種子細(xì)胞的來(lái)源提供一種途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2266688