【摘要】： 干細胞(Stem cell,SC)是一類具有自我更新和分化潛能的細胞,有很高的可塑性。在一定條件下,SCs可以分化成多種功能細胞,具有再生各種組織器官的潛在功能,醫(yī)學界稱之為“萬用細胞”。胚胎干細胞(Embryonic stem cell,ESC)是受精卵分裂發(fā)育成囊胚時,內層細胞團(Inner cell mass)來源的細胞,其發(fā)育受多種內在機制和微環(huán)境因素的影響,大量的細胞因子通過復雜的網絡聯系對細胞的增值和分化進行調控,使之向指定的方向發(fā)展。目前,科學家已經能夠在體外鑒別、分離、純化、擴增和培養(yǎng)多種動物的ESC,建立了相應的細胞系。ESC模型的建立,為體外研究胚胎發(fā)育過程中各種因子的作用機制奠定了基礎。 Sox(SRY-related HMG-box gene)因子屬于HMG(high mobility group)-box轉錄因子家族的成員,在脊椎動物中高度保守,并在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。作為Sox家族的一員,Sox17在內胚層發(fā)育過程中必不可少。利用基因打靶技術制備的Sox17基因突變(Sox17-/-)小鼠原腸發(fā)育嚴重受阻,并導致胚胎致死。在非洲爪蟾(Xenopus laevis)胚胎外胚層異位表達Sox17基因,可引起其向內胚層分化。然而,目前對Sox17的研究還不深入(尤其在哺乳動物中),其在內胚層分化過程中的作用機制尚不明確。研究表明,在爪蟾中Sox17與Wnt信號通路中的關鍵因子β-catenin相互作用,從而引起下游基因的特異性轉錄。綜上所述,針對Sox17因子的生物學功能及其作用機理的深入研究,將對闡明胚胎發(fā)育的基因調控機制,多種組織器官的發(fā)生發(fā)育過程和調控機制,以及臨床多種畸形表型的發(fā)生機制等都具有十分重要的意義。 本實驗以小鼠ESC為研究對象,將鼠外源Sox17基因轉入該細胞中,制備Sox17過表達模型,體外培養(yǎng)該細胞。以該細胞為研究對象,通過細胞形態(tài)特征、半定量RT-PCR和免疫組織化學等手段檢測其分化過程中的各項指標(細胞水平、分子水平),研究Sox17在ESC分化過程中的功能,以期進一步探討其影響內胚層分化的作用機制。本實驗結果顯示: 1.帶有鼠源Sox17基因的質粒載體pPyCAGIP通過Lipofectamine 2000轉染小鼠ESC E14/T,外源Sox17基因的轉染率大約為40%-50%。 2.與陰性對照(空載體轉染的細胞)相比,Sox17轉染的細胞在有白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)存在的培養(yǎng)基中逐漸分化:細胞群落由集中變?yōu)榉稚?干細胞多能性標志基因Oct4,Rex-1表達水平明顯下降。 3.與陰性對照相比,Sox17轉染的細胞原始內胚層標志基因Gata4,Gata6,Hnf1β,體壁內胚層標志基因LamininB1(LamB1),Thrombomodulin(TM),Disabled homolog2(Dab2),Sparc表達上升。表明Sox17誘導ESC向原始內胚層分化。 4.ESC在去除LIF的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)形成擬胚體(Embryoid body,EB)。在EBs的第二天、第六天及第十天,與對照組細胞相比,轉染了Sox17的EBs中原始內胚層標志基因Gata4,Gata6,Chicken ovalbumin upstream promoter transcription factorⅡ(Coup-tfⅡ),體壁內胚層標志基因LamB1,TM,Dab2,Sparc和臟壁內胚層標志基因Alpha fetoprotein(Afp),Bone morphogenetic protein 2(Bmp2)表達上調。終末內胚層標志基因Intestinal fatty acid binding protein(Ifabp),Pancreatic and duodenal homeobox 1(Pdx-1),中胚層標志基因Actc表達上升。另外,Wnt信號通路關鍵因子β-catenin表達水平增加。說明Sox17誘導EBs向原始內胚層及終末內胚層分化。 綜上所述,Sox17可能與β-catenin共同作用,在ESC發(fā)育過程中發(fā)揮著雙重的作用:初期可誘導ESC向原始內胚層分化;隨著ESC發(fā)育到EB階段,Sox17不僅促進原始內胚層分化,而且還誘導終末內胚層的分化,從而影響內胚層起源的器官(如肝臟、胰腺等)的形成。
[Abstract]:Stem cell (SC) is a kind of cell with self-renewal and differentiation potential, and has high plasticity. Under certain conditions, SCs can differentiate into a variety of functional cells, have the potential function of regenerating various tissues and organs, the medical profession calls the 鈥渢en thousand cells鈥，

本文編號：2262340