【摘要】： 干細(xì)胞(Stem cell,SC)是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞,有很高的可塑性。在一定條件下,SCs可以分化成多種功能細(xì)胞,具有再生各種組織器官的潛在功能,醫(yī)學(xué)界稱之為“萬用細(xì)胞”。胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell,ESC)是受精卵分裂發(fā)育成囊胚時(shí),內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)(Inner cell mass)來源的細(xì)胞,其發(fā)育受多種內(nèi)在機(jī)制和微環(huán)境因素的影響,大量的細(xì)胞因子通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系對(duì)細(xì)胞的增值和分化進(jìn)行調(diào)控,使之向指定的方向發(fā)展。目前,科學(xué)家已經(jīng)能夠在體外鑒別、分離、純化、擴(kuò)增和培養(yǎng)多種動(dòng)物的ESC,建立了相應(yīng)的細(xì)胞系。ESC模型的建立,為體外研究胚胎發(fā)育過程中各種因子的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 Sox(SRY-related HMG-box gene)因子屬于HMG(high mobility group)-box轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,在脊椎動(dòng)物中高度保守,并在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。作為Sox家族的一員,Sox17在內(nèi)胚層發(fā)育過程中必不可少。利用基因打靶技術(shù)制備的Sox17基因突變(Sox17-/-)小鼠原腸發(fā)育嚴(yán)重受阻,并導(dǎo)致胚胎致死。在非洲爪蟾(Xenopus laevis)胚胎外胚層異位表達(dá)Sox17基因,可引起其向內(nèi)胚層分化。然而,目前對(duì)Sox17的研究還不深入(尤其在哺乳動(dòng)物中),其在內(nèi)胚層分化過程中的作用機(jī)制尚不明確。研究表明,在爪蟾中Sox17與Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子β-catenin相互作用,從而引起下游基因的特異性轉(zhuǎn)錄。綜上所述,針對(duì)Sox17因子的生物學(xué)功能及其作用機(jī)理的深入研究,將對(duì)闡明胚胎發(fā)育的基因調(diào)控機(jī)制,多種組織器官的發(fā)生發(fā)育過程和調(diào)控機(jī)制,以及臨床多種畸形表型的發(fā)生機(jī)制等都具有十分重要的意義。 本實(shí)驗(yàn)以小鼠ESC為研究對(duì)象,將鼠外源Sox17基因轉(zhuǎn)入該細(xì)胞中,制備Sox17過表達(dá)模型,體外培養(yǎng)該細(xì)胞。以該細(xì)胞為研究對(duì)象,通過細(xì)胞形態(tài)特征、半定量RT-PCR和免疫組織化學(xué)等手段檢測(cè)其分化過程中的各項(xiàng)指標(biāo)(細(xì)胞水平、分子水平),研究Sox17在ESC分化過程中的功能,以期進(jìn)一步探討其影響內(nèi)胚層分化的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示: 1.帶有鼠源Sox17基因的質(zhì)粒載體pPyCAGIP通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染小鼠ESC E14/T,外源Sox17基因的轉(zhuǎn)染率大約為40%-50%。 2.與陰性對(duì)照(空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)相比,Sox17轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在有白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)存在的培養(yǎng)基中逐漸分化:細(xì)胞群落由集中變?yōu)榉稚?干細(xì)胞多能性標(biāo)志基因Oct4,Rex-1表達(dá)水平明顯下降。 3.與陰性對(duì)照相比,Sox17轉(zhuǎn)染的細(xì)胞原始內(nèi)胚層標(biāo)志基因Gata4,Gata6,Hnf1β,體壁內(nèi)胚層標(biāo)志基因LamininB1(LamB1),Thrombomodulin(TM),Disabled homolog2(Dab2),Sparc表達(dá)上升。表明Sox17誘導(dǎo)ESC向原始內(nèi)胚層分化。 4.ESC在去除LIF的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)形成擬胚體(Embryoid body,EB)。在EBs的第二天、第六天及第十天,與對(duì)照組細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染了Sox17的EBs中原始內(nèi)胚層標(biāo)志基因Gata4,Gata6,Chicken ovalbumin upstream promoter transcription factorⅡ(Coup-tfⅡ),體壁內(nèi)胚層標(biāo)志基因LamB1,TM,Dab2,Sparc和臟壁內(nèi)胚層標(biāo)志基因Alpha fetoprotein(Afp),Bone morphogenetic protein 2(Bmp2)表達(dá)上調(diào)。終末內(nèi)胚層標(biāo)志基因Intestinal fatty acid binding protein(Ifabp),Pancreatic and duodenal homeobox 1(Pdx-1),中胚層標(biāo)志基因Actc表達(dá)上升。另外,Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵因子β-catenin表達(dá)水平增加。說明Sox17誘導(dǎo)EBs向原始內(nèi)胚層及終末內(nèi)胚層分化。 綜上所述,Sox17可能與β-catenin共同作用,在ESC發(fā)育過程中發(fā)揮著雙重的作用:初期可誘導(dǎo)ESC向原始內(nèi)胚層分化;隨著ESC發(fā)育到EB階段,Sox17不僅促進(jìn)原始內(nèi)胚層分化,而且還誘導(dǎo)終末內(nèi)胚層的分化,從而影響內(nèi)胚層起源的器官(如肝臟、胰腺等)的形成。
[Abstract]:Stem cell (SC) is a kind of cell with self-renewal and differentiation potential, and has high plasticity. Under certain conditions, SCs can differentiate into a variety of functional cells, have the potential function of regenerating various tissues and organs, the medical profession calls the 鈥渢en thousand cells鈥，

本文編號(hào)：2262340