【摘要】： 神經(jīng)嵴細(xì)胞起源于背部神經(jīng)管,然后遷移到不同的組織區(qū)域形成各種各樣的細(xì)胞類型。神經(jīng)嵴干細(xì)胞/前體細(xì)胞可以分離自胚胎發(fā)育期和成體期的不同組織:神經(jīng)嵴外植體、坐骨神經(jīng)、背根節(jié)、腸神經(jīng)節(jié)、角膜、骨髓、觸須墊、頸動(dòng)脈體和心臟。皮膚來(lái)源前體細(xì)胞(skin-derived progenitors, SKP)來(lái)自于胚胎期神經(jīng)嵴干細(xì)胞,并且存在于成體期。人、嚙齒類和豬的SKP細(xì)胞具有多能性,能分化產(chǎn)生神經(jīng)胚層和中胚層起源的子代細(xì)胞。但是,關(guān)于SKP多能性的分子機(jī)制尚不清楚。本研究首先從第40-50天豬胎兒皮膚組織分離表達(dá)綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescence protein, EGFP)的豬皮膚來(lái)源前體細(xì)胞,證明其多向分化潛能,同時(shí)鑒定出關(guān)于其多能性和神經(jīng)嵴起源的多種分子標(biāo)志。其次,通過(guò)高通量基因芯片技術(shù)比較了豬SKP細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞(神經(jīng)球)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜,同時(shí)比較了豬SKP細(xì)胞和SKP來(lái)源的類成纖維細(xì)胞(SKP-derived fibroblast-like cells, SFC)的基因表達(dá)譜。最后,通過(guò)基因功能注解和KEGG通路分析,發(fā)現(xiàn)了幾種相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)源調(diào)控機(jī)制和外源信號(hào)通路,它們對(duì)調(diào)控SKP細(xì)胞的多能性起重要作用。 一SKP細(xì)胞的多能性和特異性標(biāo)志分子的表達(dá) 1本研究從第40~50天豬胎兒皮膚組織中分離了表達(dá)綠色熒光蛋白的SKP細(xì)胞,其在無(wú)血清和高濃度EGF和bFGF存在時(shí)可以形成懸浮的球形結(jié)構(gòu)。 2通過(guò)RT-PCR證實(shí)了豬SKP細(xì)胞共表達(dá)多能性相關(guān)基因(POU5F1、SOX2、NANOG和STAT3)和神經(jīng)嵴標(biāo)志分子(p75NTR、TWIST1、PAX3、SNAI2、SOX9和SOX10),這與胚胎神經(jīng)嵴干細(xì)胞的表達(dá)譜類似,說(shuō)明豬SKP細(xì)胞的神經(jīng)嵴源性。 3通過(guò)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)豬SKP球中POU5F1、巢蛋白、纖連蛋白和波形蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的比例分別為12.3%、15.1%、67.9%和53.7%,這說(shuō)明豬SKP球具有異質(zhì)性。 4通過(guò)體外誘導(dǎo)分化和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),豬SKP細(xì)胞分化培養(yǎng)物中存在表達(dá)微管蛋白β-III、神經(jīng)絲蛋白M、GFAP、p75NTR和平滑肌肌動(dòng)蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞。這說(shuō)明豬SKP細(xì)胞可以分化產(chǎn)生神經(jīng)(神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞)和中胚層細(xì)胞類型(平滑肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞),證明其具有多向分化能力。 5通過(guò)使用不同的培養(yǎng)體系和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)四種轉(zhuǎn)錄因子(POU5F1、SNAI2、SOX9和PAX3)的表達(dá)水平在生長(zhǎng)因子(EGF和bFGF)和FBS存在時(shí)有顯著性差異。POU5F1、SNAI2、SOX9和PAX3可能是維持SKP細(xì)胞體外多能性的關(guān)鍵因子。?二豬SKP細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的基因芯片分析 1本研究從第40~50天豬胎兒大腦組織中分離了表達(dá)綠色熒光蛋白的神經(jīng)干細(xì)胞/神經(jīng)球(neurospheres),同時(shí)從同一個(gè)胎兒中分離了皮膚來(lái)源的前體細(xì)胞。它們?cè)谕环N培養(yǎng)液(DMEM/F12+B27+N2+EGF+bFGF)中可形成懸浮的球形結(jié)構(gòu)。 2通過(guò)體外誘導(dǎo)分化和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),豬神經(jīng)干細(xì)胞可分化形成神經(jīng)和膠質(zhì)細(xì)胞后代,證明其具有多能性;而豬SKP在體外能分化成神經(jīng)和中胚層來(lái)源的子代細(xì)胞。 3通過(guò)RT-PCR對(duì)豬神經(jīng)干細(xì)胞和SKP細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn),它們都表達(dá)NANOG、STAT3、TWIST1、p75NTR、巢蛋白、纖連蛋白和波形蛋白。但是,豬神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)較高水平的SOX2,而且也表達(dá)GFAP。然而,SNAI2只在SKP球中表達(dá)。這說(shuō)明神經(jīng)干細(xì)胞和SKP球有類似的表達(dá)譜,但是有各自特異的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。 4通過(guò)高通量的基因芯片技術(shù)比較了豬SKP球和神經(jīng)球的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)SKP球高表達(dá)254個(gè)轉(zhuǎn)錄物,而神經(jīng)干細(xì)胞有484個(gè)轉(zhuǎn)錄物高表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),SKP球和神經(jīng)球共同高表達(dá)142個(gè)基因,他們分別涉及核糖體功能、緊密連接、間隙連接、細(xì)胞通訊、鈣離子信號(hào)、ErbB信號(hào)、JAK-STAT信號(hào)以及MAPK信號(hào)等。 5在1336個(gè)篩選出的轉(zhuǎn)錄物中,發(fā)現(xiàn)在SKP球和神經(jīng)球中72個(gè)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P0.05)。這些差異表達(dá)的基因主要涉及生理過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、信號(hào)刺激反應(yīng)、發(fā)育過(guò)程、生物過(guò)程的條件和行為。 6功能注解聚類分析發(fā)現(xiàn)豬SKP球和神經(jīng)球共同高表達(dá)基因主要涉及以下功能:RNA結(jié)合、蛋白質(zhì)的生物合成以及核糖體等。對(duì)SKP球和神經(jīng)球差異表達(dá)基因功能分析發(fā)現(xiàn),膠原蛋白異構(gòu)體和核心蛋白聚糖在細(xì)胞通訊、皮膚發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及胞外基質(zhì)作用等方面發(fā)揮作用。 7 KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),豬SKP球和神經(jīng)球共表達(dá)基因涉及淀粉和蔗糖代謝、糖酵解、緊密連接、間隙連接、嘌呤代謝、谷氨酸鹽代謝、細(xì)胞通訊、MAPK信號(hào)、鈣離子信號(hào)、ErbB信號(hào)和JAK-STAT信號(hào)等通路;而它們差異表達(dá)基因主要涉及ECM受體和TGF-β信號(hào)通路。細(xì)胞通訊信號(hào)整合ECM-受體相互作用和TGF-β信號(hào)通路,可能對(duì)于維持豬SKP球和神經(jīng)球特異的干細(xì)胞性質(zhì)起重要作用。 三豬SKP細(xì)胞中胚層潛能的基因芯片分析 1豬SKP細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中形成球狀結(jié)構(gòu),但是在血清作用下貼壁生長(zhǎng)形成類成纖維細(xì)胞。通過(guò)體外誘導(dǎo)分化和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),在SKP細(xì)胞分化為SFC過(guò)程中,其神經(jīng)分化能力逐漸喪失而仍保留中胚層分化能力。 2通過(guò)RT-PCR比較豬SKP球和SFC標(biāo)志基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)它們都表達(dá)NANOG和STAT3,以及神經(jīng)嵴細(xì)胞分子標(biāo)志TWIST1、SNAI2和p75NTR。然而,SOX10只在SKP細(xì)胞中表達(dá),可能與SKP的外周神經(jīng)分化潛能有關(guān)。 3通過(guò)對(duì)豬SKP和SFC細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)在SKP分化為SFC細(xì)胞過(guò)程中共有401個(gè)基因的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P0.05),其中,305個(gè)基因表達(dá)上調(diào)和96個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。 4通過(guò)功能注解聚類分析發(fā)現(xiàn),上調(diào)表達(dá)基因主要涉及結(jié)合功能、細(xì)胞過(guò)程以及代謝過(guò)程;下調(diào)表達(dá)基因比較重要的GO(gene ontology)功能是磷酸化蛋白和結(jié)合活性。 5通過(guò)KEGG和BIOCARTA通路分析發(fā)現(xiàn),下調(diào)表達(dá)基因主要涉及突觸蛋白、Rac1細(xì)胞運(yùn)動(dòng)信號(hào)通路、Ran對(duì)有絲分裂紡錘體的調(diào)控、Dicer通路以及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)等內(nèi)源性機(jī)制;而上調(diào)表達(dá)基因參與了一些外源性信號(hào)通路,例如ErbB通路、MAPK通路、ECM-受體相互作用、Wnt信號(hào)、細(xì)胞通訊和TGF-β信號(hào)通路。這些內(nèi)源性機(jī)制和外源性的信號(hào)通路共同調(diào)節(jié)SKP到SFC的基因轉(zhuǎn)錄狀態(tài)改變。 6為了驗(yàn)證基因芯片數(shù)據(jù),本研究通過(guò)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)14個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量qPCR分析。定量PCR使用在制作基因芯片時(shí)擴(kuò)增的cDNA作為模板。實(shí)時(shí)定量qPCR數(shù)據(jù)與基因芯片數(shù)據(jù)的表達(dá)譜類似,證明了基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2262210