發(fā)布時(shí)間：2018-10-08 21:49

【摘要】： 【研究背景】 皮膚缺損是外科中的常見(jiàn)問(wèn)題。盡早封閉創(chuàng)面,減少機(jī)體消耗和內(nèi)環(huán)境紊亂是治療皮膚缺損的關(guān)鍵。燒傷外科中大面積燒傷病人皮源缺乏,自體皮膚移植是目前臨床治療全層皮膚缺損最有效的方法。但是自體刃厚皮移植皮片易收縮,不耐摩擦,中厚皮有瘢痕攣縮等問(wèn)題。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展,皮膚替代物的研究取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。種子細(xì)胞的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增是組織工程學(xué)研究中最基礎(chǔ)的工作。 2001年,Zuk [1]等首次分離培養(yǎng)出能夠自我復(fù)制、穩(wěn)定增殖,并具有多向分化潛能的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。ADSCs來(lái)自中胚層,在特定條件下可分化為脂肪、骨、軟骨、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等[1 4]。ADSCs具有來(lái)源豐富、方便取材、低免疫原性、容易體外擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn),在組織工程、創(chuàng)面修復(fù)及基因治療方面具有良好的應(yīng)用前景。近年來(lái)研究表明,ADSCs在體外培養(yǎng)過(guò)程中加入不同的刺激因子,模擬皮膚的微環(huán)境,能誘導(dǎo)成為具有各種表型的細(xì)胞。Ramos等[5]證實(shí),將分選純化后的ADSCs植入裸鼠體內(nèi),可顯著促進(jìn)創(chuàng)面愈合,且具有表皮細(xì)胞再生的能力。人角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚創(chuàng)面修復(fù)的重要細(xì)胞,而表皮生長(zhǎng)因子(epithelial growth factor,EGF)是創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中的關(guān)鍵因子。EGF能促進(jìn)細(xì)胞增殖、表皮再生、血管形成,同時(shí)能刺激表皮細(xì)胞合成分泌膠原、透明質(zhì)酸等細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)結(jié)締組織細(xì)胞的生長(zhǎng)[6]。Shikiji等[7]成功地應(yīng)用EGF誘導(dǎo)體外培養(yǎng)于立體膠原表面的人表皮細(xì)胞向膠原內(nèi)生長(zhǎng)并形成汗腺管結(jié)構(gòu)。因此,本實(shí)驗(yàn)研究利用pcDNA3.1(+)/SP+EGF質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的HaCat細(xì)胞誘導(dǎo)人ADSCs體外轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞表型的可行性,為其在組織工程中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 【研究目的】 1、探索高效分離和擴(kuò)增人脂肪干細(xì)胞的方法,觀察其生物學(xué)特性,并通過(guò)形態(tài)學(xué)、免疫表型及多向分化能力進(jìn)行鑒定。 2、探索人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向表皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的方法。 【研究?jī)?nèi)容】 1、膠原酶消化法分離培養(yǎng)ADSCs,利用形態(tài)學(xué)及MTT比色法觀察細(xì)胞生物學(xué)特性。 2、通過(guò)流式細(xì)胞儀及誘導(dǎo)多向分化鑒定ADSCs。 3、利用轉(zhuǎn)染EGF的HaCat細(xì)胞,與ADSCs共培養(yǎng),誘導(dǎo)ADSCs向表皮細(xì)胞分化。 4、利用外源性EGF誘導(dǎo)ADSCs向表皮細(xì)胞分化。 【研究結(jié)果】 1、原代和傳代細(xì)胞呈梭形外觀,生長(zhǎng)增殖能力良好。細(xì)胞傳代后2天內(nèi)處于潛伏期,第3天進(jìn)入生長(zhǎng)期,5天后進(jìn)入平臺(tái)期。 2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD29、CD31、CD34、CD45、CD90、CD105陽(yáng)性率分別為73.4%、3.6%、4.5%、2.0%、97.3%、80.4%。經(jīng)定向誘導(dǎo)分化后,細(xì)胞分別呈現(xiàn)脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞的表型特征。 3、ADSCs與轉(zhuǎn)染EGF的HaCat細(xì)胞共培養(yǎng)后ADSCs表達(dá)表皮細(xì)胞特征性表面抗原,提示利用此方法可誘導(dǎo)ADSCs向表皮細(xì)胞分化。 4、加入EGF刺激后ADSCs中表皮細(xì)胞表面抗原CK19、integrin-β的mRNA水平隨時(shí)間增加而上升,誘導(dǎo)4w后時(shí)表達(dá)最高。 【研究結(jié)論】 1、酶消化法能有效分離純化人ADSCs,細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定,增殖能力活躍,具有ADSCs的一般生物學(xué)特性。 2、轉(zhuǎn)染EGF的HaCat細(xì)胞可誘導(dǎo)ADSCs向表皮細(xì)胞表型分化,從而為其成為組織工程理想的種子細(xì)胞提供了進(jìn)一步的支持。 3、EGF在誘導(dǎo)ADSCs向表皮細(xì)胞分化的過(guò)程中起著決定性作用, 4、合理有效地利用ADSCs在創(chuàng)面愈合的研究與治療方面具有廣闊的前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 都義日,付小兵,李存保,孫同柱,方利君;表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子在體誘導(dǎo)豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向皮膚組織分化作用的研究[J];創(chuàng)傷外科雜志;2005年02期

2 蔡颯;付小兵;雷永紅;韓冰;郭永峰;孫同柱;王君;李海紅;;在體誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化的初步實(shí)驗(yàn)研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年21期

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