【摘要】：目的: 從人胎盤中分離、培養(yǎng)和純化間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),探索四種誘導(dǎo)方案使人胎盤間充質(zhì)干細胞(Human placenta mesenchymalstem cells,hPL-MSCs)分化為胰島β樣細胞。方法:1.胎盤間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 經(jīng)膠原酶Ⅱ消化和貼壁培養(yǎng)法,從胎盤組織中獲取MSCs。采用流式細胞儀檢測細胞表面標志以及測定細胞周期。RT-PCR檢測SSEA-4的表達。誘導(dǎo)細胞向脂肪細胞、成骨細胞分化,并以油紅O染色、堿性磷酸酶染色和Von Kossa染色進行鑒定。2.誘導(dǎo)胎盤間充質(zhì)干細胞向胰島β樣細胞分化 方案1:①IMDM(含5%FBS)添加β-巰基乙醇(β-Me)誘導(dǎo)2d;②經(jīng)消化后,以添加了激活素A、全反式維甲酸和2%B27的IMDM誘導(dǎo)2d;③用含100ng/mL表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)和纖連蛋白(FN)的IMDM(含3%FBS)誘導(dǎo)5d;④在DMEM/F12(含3%～5%FBS)培養(yǎng)基中加入β細胞調(diào)節(jié)素(BTC)、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)和尼克酰胺(NIC)誘導(dǎo)7～9d。 方案2:在方案1的基礎(chǔ)上降低EGF用量(20ng/mL),不添加FN,未經(jīng)過消化過程。 方案3:前3步和方案1相同,但最后1步采用高糖(添加相同的細胞因子)誘導(dǎo)。 方案4:構(gòu)建含pdx-1基因的重組腺病毒載體,并于293細胞中包裝出完整的腺病毒(pAdxsi-CMV-Pdxl)。以pAdxsi-CMV-Pdxl病毒感染hPL-MSCs,經(jīng)消化后再以EGF、bFGF、肝細胞生長因子(HGF)、BTC、GLP和NIC進行誘導(dǎo)。 經(jīng)誘導(dǎo)后的細胞用化學發(fā)光免疫法檢測培養(yǎng)上清中胰島素和C肽的分泌量,并進行胰島素釋放實驗;RT-PCR檢測胰島相關(guān)基因的表達;免疫細胞化學染色檢測誘導(dǎo)后的細胞是否表達PDX-1,Insulin和C肽;Western blot檢測細胞內(nèi)是否含有PDX-1和Insulin。3.誘導(dǎo)后的細胞在1型糖尿病小鼠體內(nèi)的作用 采用鏈脲霉素一次性腹腔注射法制備1型糖尿病小鼠模型,將誘導(dǎo)后的細胞注射到小鼠右側(cè)腎被膜下,觀察小鼠血糖變化;移植術(shù)后第24d,摘除其右腎以觀察血糖是否反彈,最后取小鼠的腎臟和胰腺進行免疫組化檢測。結(jié)果:1.胎盤間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 胎盤MSCs表達CD44、CD29,不表達CD34、CD45、CDl06、CDl4、CD40和HLA-DR。細胞周期分析顯示92.6%的細胞處在G0/G1期。向脂肪細胞誘導(dǎo)10d后,油紅O染色為陽性。向成骨誘導(dǎo)3w,堿性磷酸酶染色和Von Kossa染色也均為陽性。而且hPL-MSCs能表達SSEA-4。2.胰島β樣細胞分化的鑒定 經(jīng)過誘導(dǎo)后的細胞聚集形成胰島樣細胞團。RT-PCR顯示誘導(dǎo)后的細胞表達胰島相關(guān)基因。免疫細胞化學染色表明誘導(dǎo)后的細胞表達PDX-1,胰島素和C肽。Western blot也證實誘導(dǎo)后的細胞含有PDX-1和胰島素。 經(jīng)方案1誘導(dǎo)后的細胞分泌胰島素的濃度為(222.00±584.97)mU/L,與方案2(72.00:±27.75)mU/L、方案4(722.00±51 79.36)mU/L、MSC組(0.08±50.03)mU/L和空載體組(1.40±0.57)mU/L相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);方案3(226.00:±73.35)mU/L與MSC組(0.08±0.03)mU/L相比,差異也有統(tǒng)計學意義(P0.05)。方案1、方案2、方案3、方案4誘導(dǎo)的細胞以5.5mmol/L和25mmmol/L葡萄糖分別刺激1h后,刺激指數(shù)分別為4.69±2.18,2.40±1.04,3.49±1.70,4.91±1.80。 而經(jīng)方案4誘導(dǎo)后的細胞分泌的C肽為(3.380±52.3lO)ng/mL,與方案1(0.447±0.381)ng/mL、MSC組(0ng/mL)和空載體組(0ng/mL)相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.誘導(dǎo)后的細胞在1型糖尿病小鼠體內(nèi)的作用 誘導(dǎo)后的細胞注射到1型糖尿病小鼠腎被膜后,血糖逐漸下降,但是在下降過程中,部分小鼠的血糖會出現(xiàn)波動。直到實驗結(jié)束,實驗組小鼠的血糖降至6-8mmol/L(方案4轉(zhuǎn)基因組)或10mmol/L(方案1細胞因子組)。而對照組的小鼠血糖則持續(xù)處于高水平。實驗組的小鼠被摘除右腎后,血糖迅速反彈。 胰島素免疫組織化學染色顯示,注射誘導(dǎo)細胞的小鼠腎被膜下有大量染成棕色的胰島素陽性細胞;同時取出的小鼠胰腺顯示胰島數(shù)量仍然明顯減少,胰島內(nèi)胰島素陽性細胞極少。結(jié)論:1.胎盤中能分離出MSCs,而且能在體外擴增培養(yǎng);胎盤MSCs表達CD44、CD29,不表達CD34、CD45、CDl06、CDl4、CD40和HLA-DR;還能表達胚胎干細胞特異性標志之一的SSEA-4。2.胎盤MSCs在體外能向脂肪細胞、成骨細胞分化。3.四種誘導(dǎo)方案都能誘導(dǎo)胎盤間充質(zhì)干細胞向胰島β樣細胞分化;其中以pAdxsi-CMV-Pdxl聯(lián)合細胞因子誘導(dǎo)的方案最佳,能提高分化效率,穩(wěn)定分泌胰島素,并使糖尿病小鼠血糖降至正常水平。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329

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本文編號：2254578