【摘要】： 目的克隆人蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因及構建真核表達重組體pcDNA3.1-hPTP1B,轉(zhuǎn)染至猴腎成纖維細胞系(COS-7),表達的重組融合蛋白用親和層析法純化,初步進行了酶活性及抑制劑的實驗。 方法通過設計5'端引物和3'端引物(分別含BamH,EcoRⅠ酶切位點),取2型糖尿病人(BMI＞28kg·m~(-2))抗凝外周血,淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。提取總RNA,以Oligo dT為引物,合成出cDNA第一鏈。以RT產(chǎn)物為模板,PCR擴增出PTP1B插入片段。酶切后定向?qū)雙cDNA3.1/myc-His-B多克隆位點,構建真核表達載體pcDNA3.1-hPTP1B,轉(zhuǎn)染COS-7細胞,G-418篩選2周后取細胞裂解上清液經(jīng)Ni~(2+)親和層析柱純化后,利用PTP1B水解特異性底物4-硝基苯基磷酸二鈉鹽(pNPP-Na2-Na2)的磷酸基團而產(chǎn)生顏色反應來測定PTP1B酶的活性。主要洲定:1.PTP1B活性與PTP1B濃度的關系;2.PTP1B活性與底物pNPP-Na_2濃度的關系;3.PTP1B活性與反應溫度的關系;4.特異性抑制劑釩酸鈉(Na_3VO_4)抑制作用的濃度依賴關系及抑制類型的研究;5.常用胰島素治療藥物吡格列酮和二甲雙胍對PTP1B酶有無抑制作用的試探性研究;6.中藥老鷹茶對PTP1B酶的抑制性作用和濃度依賴關系。 結果從2型糖尿病患者外周血中擴增得到1301bp PTP1B cDNA全長序列,經(jīng)雙酶切鑒定及測序分析,表明hPTP1B已克隆到pcDNA3.1/myc-His-B中。RT-PCR和免疫印跡表明轉(zhuǎn)染成功。抑制劑研究表明:1.rhPTP1B的活性隨酶濃度底物濃度增加而增加;2.在35℃左右,rhPTP1B的活性最大;3.釩酸鈉對PTP1B的抑制作用呈濃度依賴性增強,PTP1B酶活性隨釩酸鈉濃度增加而減少,雙倒數(shù)作圖顯示,釩酸鈉的作用機制可能為非競爭性抑制作用;4.常用治療糖尿病藥物二甲雙胍和吡格列酮對PTP1B酶并無明顯抑制作用,而老鷹茶的總黃酮粗提物(TFLC)對PTP1B有明顯的抑制作用,且呈濃度依賴性增強。 結論已成功構建了真核表達載體pcDNA3.1/myc-His-hPTP1B,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到COS-7細胞中并成功表達,純化的rhPTP1B融合蛋白可用于抑制劑的研究。通過初步的抑制劑研究對影響PTP1B的活性的反應條件和一些抑制劑的抑制特點有所了解。
[Abstract]:Objective to clone human tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) gene and construct eukaryotic expression recombinant pcDNA3.1-hPTP1B, into monkey renal fibroblast cell line (COS-7). The recombinant fusion protein was purified by affinity chromatography. Methods 5 'end primers and 3' end primers (including BamH,EcoR 鈪，

本文編號：2253988