【摘要】： Notch信號(hào)通路是細(xì)胞間一種保守的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡能力的信號(hào)機(jī)制。已有研究證實(shí),造血干細(xì)胞的Notch信號(hào)通路通過細(xì)胞表面受體與其配體Jagged或Delta相結(jié)合而激活,從而對(duì)其在我更新和分化方面起著至關(guān)重要的作用。近年來的研究表明,Notch信號(hào)通路在牙齒的修復(fù)過程中起著關(guān)鍵性的作用,牙齒受損誘發(fā)其受體、配體表達(dá),參與Notch信號(hào)通路與牙髓干細(xì)胞向血管周細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化過程。根據(jù)已有的研究,認(rèn)為在造血干細(xì)胞中,Notch信號(hào)通路的激活會(huì)促使造血干細(xì)胞自我更新加快并抑制其分化。然而,在牙髓細(xì)胞中Notch信號(hào)通路的功能機(jī)制如何仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。 牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells, DPSCs)的概念由Gronthos在2000年提出,其來源于牙髓組織,被認(rèn)為是成人牙髓組織的前體,在正�；虿±頎顟B(tài)下具有分化成成牙本質(zhì)細(xì)胞的潛能。已有研究證實(shí),在體外培養(yǎng)的人牙髓干細(xì)胞中具有Notch信號(hào)通路的表達(dá)。因此,本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)下調(diào)人牙髓干細(xì)胞中的Notch配體Delta1的表達(dá),研究分析了其對(duì)細(xì)胞增殖和分化的影響。 方法: 1.細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定:牙髓干細(xì)胞來源于臨床上因正畸或阻生而拔除的健康牙齒,采用酶消化法分離獲得并常規(guī)原代并傳代培養(yǎng);鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及其克隆形成能力;利用免疫組化及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型,如Vimentin、GFAP、Nestin和collagen typeⅢ,以及間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志STRO-1;將細(xì)胞在成牙本質(zhì)誘導(dǎo)條件下培養(yǎng),觀察其分化潛能。 2.慢病毒感染:牙髓干細(xì)胞被攜帶Delta1特異性RNAi的慢病毒感染,通過Western blot、RT-PCR檢測(cè)DPSCs中Delta1基因及Notch通路靶基因Hes1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分成三組,包括由攜帶Delta1特異性RNAi慢病毒感染的DPSCs/Delta1-RNAi組,由空慢病毒感染的DPSCs/vector組和正常細(xì)胞對(duì)照DPSCs/wt組。 3.細(xì)胞增殖與分化的檢測(cè):DPSCs中Delta1被干擾下調(diào)后,通過細(xì)胞周期、CCK-8和細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)的Western blot檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;將細(xì)胞成牙本質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)后,利用堿性磷酸酶活性、茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色和DSPP的Western blot檢測(cè)細(xì)胞分化改變。 結(jié)果: 1.連續(xù)培養(yǎng)的人牙髓干細(xì)胞增殖快,單個(gè)細(xì)胞保持有2-4突起的梭形或星形;細(xì)胞具有克隆形成能力,CFU-F計(jì)數(shù)為2~15clones /103 cell;免疫組化及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示有Vimentin、GFAP、nestin和STRO-1的表達(dá)。經(jīng)成牙本質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)后,細(xì)胞出現(xiàn)了牙本質(zhì)涎磷蛋白DSPP的表達(dá),并有鈣化結(jié)節(jié)形成。 2. DPSCs/Delta1-RNAi組的Delta1表達(dá)低于DPSCs/vector組和DPSCs/wt組,而DPSCs/vector組和DPSCs/wt組的Delta1表達(dá)沒有明顯區(qū)別。 3. DPSCs/Delta1-RNAi組的細(xì)胞增長(zhǎng)率和S期及PCNA表達(dá)明顯低于DPSCs/vector組和DPSCs/wt組。與DPSCs/vector組和DPSCs/wt組相比,DPSCs/Delta1-RNAi組細(xì)胞可形成較多鈣化結(jié)節(jié),堿性磷酸酶、DSPP檢測(cè)明顯增高。另外,DPSCs/Delta1-RNAi組的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。 結(jié)論: 1.從人牙髓組織中分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞在體外具有一定的克隆形成能力,其表面分子的表達(dá)情況與文獻(xiàn)報(bào)道相似,誘導(dǎo)條件下具有分化潛能,符合成體干細(xì)胞特性。 2.人牙髓干細(xì)胞被攜帶Delta1特異性RNAi慢病毒感染后,其Delta1和Notch通路可呈穩(wěn)定低表達(dá)。 3. DPSCs/Delta1-RNAi組牙髓干細(xì)胞較DPSCs/wt組和DPSCs/vector組在相同誘導(dǎo)條件下,更易向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化。 4. Notch信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的自我更新和分化起著重要作用,Notch配體Delta1基因的低表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用,并促進(jìn)細(xì)胞在成牙本質(zhì)誘導(dǎo)條件下向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 何飛,譚穎徽,張綱;人牙髓干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2005年01期

2 楊雪超,樊明文;體外持續(xù)培養(yǎng)對(duì)人牙髓細(xì)胞分化能力的影響[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2003年02期

3 何飛,楊崢嶸,譚穎徽;Notch配體Delta1對(duì)人牙髓干細(xì)胞分化的影響[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2005年04期

4 何飛,楊崢嶸,譚穎徽;Notch配體Delta-1對(duì)人牙髓干細(xì)胞體外增殖的影響[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2005年08期

，

本文編號(hào)：2253611