【摘要】： 前言 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT),曾被稱為谷丙轉(zhuǎn)氨酶,在L-丙氨酸和α-酮戊二酸之間催化可逆性的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)形成丙酮酸和L-谷氨酸。ALT通過產(chǎn)生以上這四種重要的代謝中間產(chǎn)物,在糖異生和氨基酸代謝中起重要作用,尤其在禁食和運(yùn)動(dòng)時(shí)丙氨酸在ALT作用下通過脫氨基作用形成丙酮酸,進(jìn)而生成葡萄糖。 ALT被廣泛用作肝臟損害的標(biāo)志物。一些職業(yè)性有害因素以肝臟為主要毒作用靶器官而引起職業(yè)性中毒性肝病,如鉛、鉈等金屬及四氯化碳(carbontetrachloride,CCl_4)或有機(jī)磷等中毒時(shí)可引起血清ALT活性顯著升高。然而,血清ALT活性升高也會(huì)在非肝損害時(shí)出現(xiàn),例如多發(fā)性肌炎、肥胖、代謝性疾病以及健康受試者中。反之,血清ALT在部分已確診為肝損害的病人中并不升高,如肝硬化代償期、NASH及C型肝炎病毒感染。ALT作為肝損害的主要標(biāo)志物的原因是在于它的特異性及在肝組織中的大量表達(dá),該酶在肝損害時(shí)從肝細(xì)胞中泄漏后入血引起血清ALT升高。在先前的研究中大都測(cè)定ALT的活性,但關(guān)于該活性或活性改變的分子機(jī)制卻罕見報(bào)導(dǎo)。到目前為止我們?nèi)匀徊恢繟LT在肝損害時(shí)升高的確切機(jī)制。 近來,兩種ALT同工酶,ALT1和ALT2在人類和小鼠中均被確定,他們由不同的基因編碼并且在mRNA水平上的組織表達(dá)也不同;ALT1主要在小腸、肝臟、腎臟和心臟中表達(dá),而ALT2則主要在肌肉、腦、脂肪和腎臟中表達(dá),提示兩種同工酶在生物學(xué)上可能存在功能差別。我們推測(cè)兩種ALT同工酶都在血清中存在,并且共同構(gòu)成ALT活性,因此分別測(cè)定ALT同工酶可能對(duì)探討血清ALT升高的分子機(jī)制提供有價(jià)值的理論依據(jù)。在本研究中,我們首先檢測(cè)SD大鼠ALT同工酶在多種組織中的蛋白分布,然后采用一種經(jīng)典的職業(yè)肝損害毒物ccl_4急性腹腔注射C57816小鼠,觀察處理前后血清ALT同工酶蛋白變化;其次,克隆hALT1和hALT2 cDNA,并轉(zhuǎn)入昆蟲細(xì)胞中表達(dá)重組hALT1和hALT2蛋白,然后進(jìn)行純化,并對(duì)其進(jìn)行初步的特性識(shí)別;通過前一部分產(chǎn)生的重組hALT1和hALT2蛋白制備并純化特異性的hALT1和hALT2多克隆抗體,并利用這兩種特異性抗體去檢測(cè)人血清中ALT同工酶的蛋白表達(dá),探討肝損害時(shí)血清ALT升高的分子機(jī)制,為將來對(duì)于血清ALT改變?cè)诼殬I(yè)性肝損害、非職業(yè)因素引起的肝損害或者正常與疾病狀態(tài)的研究提供必要的基礎(chǔ)資料。血清ALT同工酶蛋白的測(cè)定,可能對(duì)于診斷職業(yè)性肝損害或非肝損害的性質(zhì)和程度提供了一個(gè)新的前景。 材料與方法 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣品制備 10只Sprague-Dowley(SD)大鼠,取肝臟、肌肉、腦組織、小腸、腎、心臟、結(jié)腸、棕色脂肪和附睪白色脂肪組織,約0.2mg組織加入lml NP40裂解液勻漿后,3,000xg,4℃離心10min,取上清,測(cè)定組織蛋白濃度,調(diào)整樣品蛋白濃度為20μg/3μl。4只8周齡雄性C57816小鼠,按2ml/kg體重腹腔注射CCl4,24h后取血清。 2、血清和肝組織ALT活性測(cè)定 利用ALT活性與單位時(shí)間內(nèi)NADH下降的吸光度呈正比,采用HTS 7000 BioRad reader測(cè)定儀測(cè)定活性,測(cè)定波長(zhǎng)340nm,組織ALT活性以組織細(xì)胞裂解液的蛋白濃度進(jìn)行校正,單位為U/mg蛋白。 3、Western blot分析 向加樣孔中依次加入預(yù)染的蛋白Marker及蛋白樣品,電泳,轉(zhuǎn)印,5%脫脂牛奶封閉、一抗,4℃搖動(dòng)孵育過夜;再加入過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗,搖床上室溫?fù)u動(dòng)45min,暗室中ECL顯影,洗片,膠片拍照后用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度值定量分析。 4、載體構(gòu)建 全長(zhǎng)hALTl cDNA和去除線粒體信號(hào)的hALT2 cDNA分別克隆入pBAC-2cp中,該載體具有6xHis-tag序列和牛腸激酶的酶切位點(diǎn),有助于純化及去除His-tag。分別命名為pBAC-2cp-hALT1和pBAC-2cp-hALT2。 5、產(chǎn)生重組病毒 pBAC-2cp-hALT1和pBAC-2cp-hALT2分別轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞,重組病毒擴(kuò)增至第4代,進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。 6、重組蛋白在High5昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及蛋白純化 利用重組hALT蛋白中含有的6×His tag能夠與Ni~(2+)特異結(jié)合的特性,先將細(xì)胞上清液過柱子,大部分不與Ni~(2+)結(jié)合的蛋白則最先流出,再用含不同濃度Imidazole的Elution buffer逐步洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白,隨著Imidazole濃度的增加,含6xHistag的重組hALT蛋白則被洗脫,達(dá)到分離純化蛋白的目的。并進(jìn)行ALT活性測(cè)定、SDS-PAGE和Western blot證實(shí)純化蛋白;牛腸激酶對(duì)6×His-tag的重組純化蛋白進(jìn)行酶切,再用Ni-NTAagarose純化酶切后的蛋白。 7、純化重組蛋白的基本特性識(shí)別 (1)溫度儲(chǔ)存條件對(duì)ALT活性的影響將純化后的重組蛋白并已去除6×His-tag的hALT1和hALT2分別放入Tris-HCl buffer(20mM Tris-HCl,pH 7.5),在-80℃、-20℃、4℃、25℃和37℃條件下儲(chǔ)存24h、48h、6days、10days、15days和20days,分別測(cè)定ALT活性。 (2)儲(chǔ)存條件對(duì)ALT活性的影響將純化后的重組蛋白放入含不同濃度甘油(0～30%)的20 mM Tris-HCl buffer,pH7.5中,在-20℃放置24h和48h,分別測(cè)定ALT活性。 (3)pH值對(duì)ALT活性的影響純化的重組蛋白在pH值從5-9的測(cè)定試劑(125mM Tris-HCl,575mM丙氨酸,16.3mMα-酮戊二酸,0.25mM NADH,3000ULDH)中檢測(cè)ALT活性。 以上操作均做3個(gè)平行樣,計(jì)算結(jié)果取平均值。 8、hALT1和hALT2多克隆抗體的制備及純化 由美國(guó)AbboMax公司生產(chǎn)抗體,再自行純化。先將hALT1多克隆抗體過偶聯(lián)重組hALT2蛋白的柱子,再將流出的抗體過偶聯(lián)上重組hALT1蛋白的柱子,然后再用pH 2.7和1.9的Elution buffer將抗體洗下,并馬上用Neutralization buffer中和,即為純化后的hALT1抗體;同理,純化hALT2抗體。 9、正常健康受試者和肝損害患者血清ALT活性及ALT同工酶蛋白檢測(cè) 采集4名健康志愿者及4名臨床肝活檢確診肝損害患者的空腹血清,檢測(cè)ALT活性,Westem blot測(cè)定血清中ALT同工酶蛋白表達(dá) 10、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及配對(duì)樣品t檢驗(yàn)。 結(jié)果 1、ALT同工酶在雄性和雌性SD大鼠組織中的蛋白表達(dá) ALT1和ALT2在肝臟和肌肉中表達(dá)最高。ALT同工酶在組織中表達(dá)最大的差別在于小腸高表達(dá)ALT1,而無ALT2表達(dá)。 2、大鼠ALT同工酶在肝臟和肌肉組織中蛋白表達(dá)的性別差異 雄性大鼠肝臟ALT2蛋白表達(dá)大約是雌性大鼠的4倍(P0.01),而肌肉ALT2蛋白表達(dá)約是雌性大鼠的2倍(P0.05);肝臟的ALT1蛋白表達(dá)水平上未發(fā)現(xiàn)性別差異,但雄性比雌性大鼠ALT1約高20%;雄性大鼠肝組織ALT活性顯著高于雌性大鼠(P0.05)。 3、CCl4處理前后小鼠血清ALT變化 小鼠血清ALT1和ALT2蛋白和活性在CCl4處理后均顯著升高:處理后ALT活性顯著增加66倍,ALTl和ALT2蛋白也分別增加4.1倍和2.9倍。ALT1和ALT2蛋白都與活性增加有相關(guān)趨勢(shì)。 4、hALT1和hALT2的cDNA克隆、蛋白表達(dá)及純化 hALT1 cDNA全長(zhǎng)和hALT2 cDNA(去除線粒體信號(hào))成功克隆入pBAC-2cp載體中。成功轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,產(chǎn)生并擴(kuò)增重組病毒,感染High5細(xì)胞,產(chǎn)生并純化重組蛋白,具有6×His-tag的重組蛋白被牛腸激酶酶切后,Ni-NTA agarose分離純化不含His-tag的蛋白。 5、溫度對(duì)重組hALT1和hALT2蛋白活性的影響 在20mM Tris-HCl(pH7.5)buffer,37℃時(shí),ALT1活性迅速降低,在24h內(nèi)丟失50%的活性,并在第6天失去所有活性。在4℃、25℃和-80℃,直到第10天ALT1仍保持大約80%-90%的活性,在25℃時(shí)第20天活性降為60%,而在4℃和-80~C則一直保持穩(wěn)定。有意義的是在-20℃,ALT1在最初的48h內(nèi)就丟失了43%的活性,但卻保持相對(duì)的穩(wěn)定直到20天。與ALT1相比,ALT2活性除-80℃外,其他所有被測(cè)溫度均迅速降低,并且儲(chǔ)存溫度越低,活性保存的越多。在最初的48h,37℃、25℃、4℃和-20℃時(shí)ALT2活性分別丟失72%、56%、53%和44%:但在-80℃時(shí)ALT2活性降低20%,而后一直保持穩(wěn)定直到第20天。 6、甘油對(duì)重組hALT1和hALT2蛋白活性的影響 ALT1活性隨著甘油濃度的增加而增加,當(dāng)甘油濃度達(dá)25%時(shí),在24h和48h分別保持99%和95%的活性,但進(jìn)一步增加甘油濃度到30%卻并不保持更多的活性。相比ALT1,甘油對(duì)ALT2活性的保護(hù)效應(yīng)更明顯,當(dāng)甘油濃度達(dá)25%時(shí),在24h和48h后ALT2活性仍然保持94%和89%。 7、pH值對(duì)重組hALT1和hALT2蛋白活性的影響 ALT1特異性活性在pH5.0-6.5范圍內(nèi)增加,在pH6.5-8.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定,在pH大于8.0時(shí)降低。ALT2特異性活性在pH5.0-6.5范圍內(nèi)增加,在pH6.5-8.5范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。 8、抗體純化結(jié)果 抗體純化是成功的,而1:5000的稀釋濃度可能為該抗體的最佳濃度 9、正常健康志愿者與肝損害患者血清ALT活性及同工酶蛋白表達(dá) 肝損害患者與正常健康志愿者相比,血清ALT活性顯著升高(P0.01)。通過hALT1和hALT2特異性抗體,我們?cè)诰哂姓LT活性的健康志愿者和ALT活性異常增高的肝損害患者血清中均可檢測(cè)到ALT1和ALT2蛋白�；叶戎捣治鲲@示高ALT活性的肝損害患者ALT1蛋白表達(dá)顯著高于正常健康志愿者(P0.05),ALT2蛋白表達(dá)也較正常健康志愿者高,但并無顯著性差別。結(jié)合ALT活性定量分析,提示高ALT活性肝損害患者ALT同工酶蛋白的表達(dá)是增加的,但與活性并不成一致的相關(guān)。 結(jié)論 1、ALT同工酶蛋白在大鼠組織中廣泛表達(dá),且ALT1比ALT2具有更廣泛的組織分布;小腸中僅表達(dá)ALT1,且表達(dá)量非常高,但卻無ALT2表達(dá)。肝臟ALT2蛋白表達(dá)存在性別差異,雄性大鼠顯著高于雌性大鼠;雄性大鼠肝臟ALT活性也顯著高于雌性大鼠。CCl4處理小鼠血清ALT1和ALT2蛋白增加。 2、hALT1和hALT2重組蛋白可以通過Ni~(2+)螯合柱,經(jīng)Imidazole梯度洗脫一步純化。與hALT1相比,hALT2重組蛋白不穩(wěn)定并且很難通過調(diào)整pH值來分別測(cè)定ALT同工酶活性。 3、在當(dāng)前測(cè)定條件下,如果組織或血清樣品ALT1和ALT2蛋白水平相當(dāng),那么所測(cè)得的ALT活性主要來源于ALT1。 4、正常健康志愿者及肝損害患者血清中均可檢測(cè)到ALT同工酶蛋白;肝損害患者血清ALT活性及ALT1蛋白表達(dá)顯著升高,ALT2蛋白表達(dá)也較正常健康志愿者高,但并無顯著性差別。高ALT活性肝損害患者ALT同工酶蛋白的表達(dá)增加,但與活性并不成一致的相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R363

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周強(qiáng);運(yùn)動(dòng)疲勞及其恢復(fù)過程中血清酶活性變化[J];現(xiàn)代康復(fù);2001年13期

2 王厚行;;比較和評(píng)價(jià)分離兩種谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)同工酶的柱層析法和電泳法[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;1981年03期

3 周德榮,孟會(huì)英;小劑量γ射線對(duì)人體血清LDH及其同工酶的影響[J];輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào);1987年01期

4 李貴生;孟陽春;;三種革螨同工酶的比較研究[J];廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào);1989年02期

5 張學(xué)舜;何學(xué)謙;肖開進(jìn);張瑞瓊;黃懷昭;周乃祥;佘陸君;;黃牛睪丸、附睪和精液乳酸脫氫酶—X(LDH—X)測(cè)定研究[J];中國(guó)牛業(yè)科學(xué);1990年01期

6 曹麗萍,何麟;三種蚤酯酶同工酶的比較分析[J];中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;1991年03期

7 SfurK A d Sanders GTB ,薛建中;巨酶:出現(xiàn)率、組成、檢測(cè)與臨床聯(lián)系[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;1991年05期

8 高天霞;秦振棟;;稀脈浮萍6746光周期誘導(dǎo)開花過程中幾種同工酶的變化及其與開花的關(guān)系[J];淮北煤炭師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1991年02期

9 王培昌，，王詩謹(jǐn)，王清紅;食管癌酶學(xué)診斷進(jìn)展[J];河南腫瘤學(xué)雜志;1994年01期

10 彭宗生 ,張麗杰 ,趙振軍;肌酸激酶同工酶與亞型在臨床診療中的應(yīng)用[J];中國(guó)療養(yǎng)醫(yī)學(xué);2003年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 黃卓烈;巫光宏;詹福建;譚紹滿;;幾個(gè)桉樹無性系過氧化物酶活性及其同工酶的器官特異性[A];中國(guó)植物學(xué)會(huì)七十周年年會(huì)論文摘要匯編（1933—2003）[C];2003年

2 黃志斌;吳淑勤;石存彬;潘厚軍;李凱彬;;劍尾魚不同組織中同工酶的研究[A];中國(guó)動(dòng)物科學(xué)研究——中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)第十四屆會(huì)員代表大會(huì)及中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)65周年年會(huì)論文集[C];1999年

3 余小林;曹家樹;葉紈芝;;CYP86MF反義基因轉(zhuǎn)化不育植株相關(guān)同工酶的比較[A];中國(guó)園藝學(xué)會(huì)第六屆青年學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2004年

4 劉保忠;相建海;張首臨;;櫛孔扇貝同工酶的生化遺傳分析[A];中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)、中國(guó)海洋湖沼學(xué)會(huì)貝類學(xué)分會(huì)第八次學(xué)術(shù)討論會(huì)暨張璽教授誕辰100周年紀(jì)念會(huì)論文集[C];1997年

5 吳士筠;裴國(guó)鳳;李曉峰;;La(Ⅲ)對(duì)玉米種子萌發(fā)及酯酶同工酶的影響[A];湖北省暨武漢市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)第七屆第十四次學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2003年

6 宓慶梅;吳飛;曹魯寧;仲人前;;乳酸脫氫酶同工酶第6條帶的檢測(cè)(LDH6)[A];第五次全國(guó)中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

7 吳燕燕;韓君莉;李來好;;吉富羅非魚不同組織中4種同工酶研究[A];2007年中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)暨水產(chǎn)微生態(tài)調(diào)控技術(shù)論壇論文摘要匯編[C];2007年

8 趙清;金立仁;魏盟;;高肌酸激酶同工酶血癥一例[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì)第八次全國(guó)心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議匯編[C];2004年

9 宓慶梅;曹魯寧;孔憲濤;;偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶測(cè)定天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶同工酶方法的建立[A];第十屆全軍檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

10 張金祥;王迪;李穎;簡(jiǎn)桂良;;不同致病力棉花黃萎病菌菌株在線粒體基因組存在差異[A];中國(guó)第六屆海峽兩岸菌物學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 齊軍;如何知道乙肝轉(zhuǎn)為肝癌了[N];健康報(bào);2005年

2 謝長(zhǎng)峰 本報(bào)記者 汪言安 付宇銳;萬艾可陷入副作用危機(jī)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2005年

3 張中橋;診斷心肌梗塞只需15分鐘[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2000年

4 本報(bào)特約撰稿人 陸志城;ED治療藥之爭(zhēng)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2004年

5 廖沙 謝劍煒;Caco-2細(xì)胞模型助力新藥研發(fā)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

6 張義;我國(guó)苜蓿品種鑒定三大要素[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2004年

7 梁文;分子標(biāo)記技術(shù)為種子檢測(cè)提供“法眼”[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2005年

8 曉楚;姜春華治療慢性肝炎的經(jīng)驗(yàn)[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2000年

9 ;疾病檢查常規(guī)[N];農(nóng)村醫(yī)藥報(bào)（漢）;2006年

10 李煥榮;脂肪肝的防治[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 劉莉;四氯化碳引起小鼠血清ALT升高的分子機(jī)制及人ALT同工酶分子克隆、蛋白表達(dá)、純化及相關(guān)研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2008年

2 鄭小東;中國(guó)沿海烏賊類遺傳變異和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究[D];青島海洋大學(xué);2001年

3 程玉祥;水稻NADP-蘋果酸酶與逆境關(guān)系的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2005年

4 郭巧生;半夏遺傳多樣性的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);1998年

5 柳廣東;三種經(jīng)濟(jì)絨螯蟹的遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2005年

6 劉菁;基于微流控芯片的分析檢測(cè)系統(tǒng)研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所）;2007年

7 金基石;SOD和APX與切花月季‘Samantha’失水脅迫耐性間的關(guān)聯(lián)[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

8 魯振強(qiáng);水稻APX與CAT同工酶的功能特性及其與鹽脅迫關(guān)系的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2005年

9 王艷芳;航天誘變番茄無限生長(zhǎng)習(xí)性突變體的選育及其誘變機(jī)理研究[D];浙江大學(xué);2006年

10 唐祈林;玉蜀黍?qū)倩蚪M構(gòu)成及玉米新種質(zhì)創(chuàng)制研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 郭曉霞;蝴蝶酯酶同工酶的系統(tǒng)學(xué)研究（鱗翅目、蝶亞目）[D];陜西師范大學(xué);2000年

2 佟漢文;烏拉爾甘草種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

3 林寶剛;甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系Pol、Shan2A、Ogu和Gli的比較研究[D];浙江大學(xué);2005年

4 裘麗珍;人乙醛脫氫酶2基因的克隆及表達(dá)[D];浙江大學(xué);2005年

5 韋柳枝;山東日照近海金烏賊生物學(xué)研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2005年

6 王朝明;大口鲇、鲇及其雜種F_1種質(zhì)遺傳標(biāo)記研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

7 馬淑紅;心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè)項(xiàng)目選擇及臨床意義研究[D];吉林大學(xué);2008年

8 馬勇華;達(dá)賚湖鯰魚的種質(zhì)特征研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

9 李國(guó)慶;廣東與湖南養(yǎng)殖鱖群體遺傳多樣性研究[D];華南師范大學(xué);2005年

10 曾弦;超聲處理對(duì)地靈組培苗生長(zhǎng)影響的研究[D];陜西師范大學(xué);2005年

本文編號(hào)：2251714