【摘要】： 目的：優(yōu)化重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制素(rhED)的復(fù)性方案,以提高其復(fù)性率,并初步檢測(cè)復(fù)性后rhED抗血管生成的生物活性,為rhED的進(jìn)一步研究與利用提供大量的有活性的rhED蛋白。方法：用帶有rhED cDNA的pQE3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌E.ColiM15,在IPTG的誘導(dǎo)下發(fā)酵產(chǎn)生rhED包涵體并提取rhED包涵體。復(fù)性時(shí),先用6mol/L鹽酸胍溶解提取后rhED包涵體,在適宜的尿素濃度下稀釋蛋白液并攪拌足夠長(zhǎng)的時(shí)間,結(jié)合逐級(jí)透析法進(jìn)行復(fù)性,找出復(fù)性的主要影響因子,并優(yōu)化最適復(fù)性條件。然后,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)量rhED的濃度,SDS-PAGE驗(yàn)證并計(jì)算復(fù)性得率。復(fù)性結(jié)束后陽(yáng)離子交換層析純化rhED并超濾濃縮至適宜濃度。最后,用rhED特異性單克隆抗體和雞胚絨毛尿囊膜抑制血管生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)復(fù)性后蛋白的活性。結(jié)果：1L的rhED菌種發(fā)酵液能產(chǎn)生15g rhED包涵體。通過(guò)優(yōu)化復(fù)性條件,rhED的復(fù)性率可達(dá)到46%。其中有三大重要的復(fù)性影響因素——復(fù)性時(shí)蛋白液的濃度、尿素濃度及pH值。復(fù)性時(shí)蛋白的濃度為0.3mg/ml、尿素濃度為3.5mol/L及pH為8時(shí)是適宜的復(fù)性條件。而陽(yáng)離子交換層析能很好的純化復(fù)性后的rhED。通過(guò)復(fù)性、純化后的rhED能與rhED特異性單抗反應(yīng),并在雞胚絨毛尿囊膜抑制血管生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中顯示出抑制血管生長(zhǎng)的活性。結(jié)論：至此提高rhED復(fù)性率的復(fù)性條件已經(jīng)確立,本復(fù)性方案將極大地促進(jìn)rhED的臨床前研究及臨床研究。
[Abstract]:Aim: to optimize the renaturation of recombinant human vascular endothelial cell growth inhibitor (rhED) in order to increase its renaturation rate, and to detect the anti-angiogenic bioactivity of rhED after refolding. To provide a large number of active rhED proteins for the further study and utilization of rhED. Methods: E. Coli M15 was transfected into E. Coli M15 by pQE3 expression vector with rhED cDNA. RhED inclusion bodies were produced by IPTG induction and rhED inclusion bodies were extracted. During renaturation, the inclusion bodies of rhED were extracted with 6mol/L hydrochloric acid guanidine hydrochloride, diluted with the protein solution at the appropriate urea concentration and stirred for a long time. The main influencing factors of renaturation were found by combining with the method of step by step dialysis. The optimum renaturation conditions were optimized. Then, the concentration of rhED was measured by standard curve method and SDS-PAGE was used to verify and calculate the renaturation yield. After renaturation, rhED was purified by cation exchange chromatography and concentrated to the appropriate concentration. Finally, rhED specific monoclonal antibody and chicken chorioallantoic membrane inhibition vascular growth test were used to detect the activity of renatured protein. Results 15 g rhED inclusion bodies could be produced in the fermentation broth of rhED strains at 1: 1 L. By optimizing the renaturation conditions, the renaturation rate of rhED can reach 46%. There are three important factors affecting renaturation: the concentration of protein solution, the concentration of urea and the value of pH during renaturation. The optimal renaturation conditions were protein concentration of 0.3 mg / ml, urea concentration of 3.5mol/L and pH of 8. And cationic exchange chromatography can purify rhED. after renaturation. By renaturation, the purified rhED could react with rhED specific monoclonal antibody, and showed the activity of inhibiting angiogenesis in chorioallantoic membrane of chicken embryo. Conclusion: the renaturation conditions for increasing the rate of rhED renaturation have been established, and this renaturation scheme will greatly promote the preclinical and clinical study of rhED.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R346

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