【摘要】： 目的: JC病毒屬于人類多瘤病毒屬,是一種重要的機會感染性疾病病原體。JC病毒廣泛分布于人群中,有80㳠的成人血清學(xué)檢測為陽性[1]。當(dāng)免疫力低下時,JC病毒會引發(fā)多灶性腦白質(zhì)病(PML)[2]。然而,JC病毒的臨床檢測,以及它的包膜蛋白VP2入核的機制和入核轉(zhuǎn)運受體并不清楚。本研究擬通過原核表達、抗體制備、核定位信號鑒定和入核轉(zhuǎn)運受體的鑒定幾個方面初步闡釋JC病毒的小包膜蛋白VP2基因在PML發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)功能。 方法: (1)構(gòu)建原核表達載體pET-32a(+)-VP2,轉(zhuǎn)化BL21宿主菌后經(jīng)IPTG誘導(dǎo),獲得了帶有組氨酸標(biāo)簽的重組融合蛋白的優(yōu)化表達。 (2)利用Ni+親和柱純化表達蛋白并免疫BALB /c小白鼠,獲得抗VP2多克隆抗體。以純化VP2為抗原,利用Western blot和ELISA法對多克隆抗體進行特異性和效價檢測。 (3)構(gòu)建重組綠色熒光表達載體pEGFP-C1-VP2,轉(zhuǎn)染7402細胞,24hr后觀察各截短體的亞細胞定位情況。 (4)表達純化pGEX-2T-importin(importinα1、3、5、7和imporinβ)的GST融合蛋白。 (5)通過GST-pull down方法,尋找并確定VP2的入核轉(zhuǎn)運受體。 結(jié)果: (1)通過PCR方法從病人的腦脊液中獲得VP2的目的片段,并成功構(gòu)建了pET-32a(+)-VP2原核表達載體。pET-32a(+)-VP2原核表達載體在IPTG的誘導(dǎo)作用下,成功表達融合蛋白通過Ni+親和層析法獲得了融合蛋白純品。 (2)用純化的VP2融合蛋白免疫BALB/c小鼠,成功制備了高效價,高特異性的鼠抗VP2多克隆抗體。通過ELISA法表明多克隆抗體效價1:160,000, Western blot檢測證明多克隆抗體的特異性良好。 (3)通過PCR方法獲得了VP2截短體的目的片段,成功構(gòu)建了VP2各截短體的綠色熒光表達載體;將構(gòu)建好的VP2各截短體綠色熒光表達載體轉(zhuǎn)染7402人肝癌細胞,通過各截短體的亞細胞定位分析出了VP2蛋白的核定位信號為946-972段。 (4)成功表達純化了五個pGEX-2Timportin融合蛋白。 (5)通過GST-pull down實驗,分析發(fā)現(xiàn)VP2能夠與入核轉(zhuǎn)運受體蛋白importinα1、importinα3結(jié)合,從而被轉(zhuǎn)運入細胞核,發(fā)揮它的生理和生化作用。 結(jié)論: 1.我們成功構(gòu)建了pET-32a(+)- Vp2原核表達載體,在IPTG的誘導(dǎo)下,成功表達純化了VP2融合蛋白。這就為抗體的制備以及研究VP2蛋白與其它蛋白的相互作用做了物質(zhì)上的準(zhǔn)備。 2.將VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制備了高效價、高特異性的鼠抗VP2多克隆抗體。這對于VP2抗原的檢測,以及免疫組化奠定了基礎(chǔ)。 3.成功的鑒定出VP2的核定位信號,通過構(gòu)建四個pEGFP-C1-Vp2綠色熒光載體,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染7402細胞株,在熒光顯微鏡下觀察pEGFP-C1-Vp2各截短體的亞細胞定位。這是第一次鑒定出VP2的核定位信號,為進一步的研究提供了信息。 4.通過GST-pull down方法,我們成功的鑒定出VP2的入核轉(zhuǎn)運受體為importinα1、importinα3。初步闡明了VP2入核過程中參與的入核轉(zhuǎn)運受體。
[Abstract]:Objective: JC virus belongs to human polytumour virus, which is an important opportunistic infectious disease pathogen. JC virus is widely distributed in the population, has 80? The adult serological test was positive [1]. When immunity is low, JC virus can cause multiple focal white matter disease (PML) [2]. However, the clinical detection of JC virus, the mechanism of its envelope protein VP2 entry and its nuclear transporter receptor are not clear. The purpose of this study was to elucidate the biological function of the small envelope protein VP2 gene of JC virus during the development of PML through prokaryotic expression, antibody preparation, nuclear localization signal identification and nuclear transport receptor identification. Methods: (1) the prokaryotic expression vector pET-32a () -VP2was constructed and transformed into BL21 host strain and induced by IPTG. The optimized expression of recombinant fusion protein with histidine label was obtained. (2) Ni affinity column was used to purify the expressed protein and immunize BALB / c mice to obtain anti-VP2 polyclonal antibody. Using purified VP2 as antigen, Western blot and ELISA were used to detect the specificity and titer of polyclonal antibody. (3) Construction of recombinant green fluorescent expression vector pEGFP-C1-VP2, for 24 hours after transfection to 7402 cells to observe the subcellular localization of each truncated body. (4) expression and purification of the GST fusion protein of pGEX-2T-importin (importin 偽 _ 1H _ 3H _ 5N _ 7 and imporin 尾). (5) the fusion protein was purified by GST-pull down. To identify the nuclear transporter receptor of VP2. Results: (1) the target fragment of VP2 was obtained from cerebrospinal fluid of patients by PCR method, and pET-32a () -VP2 prokaryotic expression vector. PET-32a () -VP2 prokaryotic expression vector was successfully constructed under the induction of IPTG. The fusion protein was successfully expressed by Ni affinity chromatography. (2) the purified VP2 fusion protein was used to immunize BALB/c mice, and a high titer and high specificity mouse anti-VP2 polyclonal antibody was successfully prepared. The polyclonal antibody titer was 1: 160 ~ (000) by ELISA, and the specificity of the polyclonal antibody was proved by Western blot. (3) the target fragment of VP2 truncated body was obtained by PCR method, and the green fluorescent expression vector of VP2 truncated body was constructed successfully. The constructed VP2 truncated green fluorescent expression vectors were transfected into 7402 human hepatoma cells. The nuclear localization signal of VP2 protein was 946-972. (4) five pGEX-2Timportin fusion proteins were successfully expressed and purified. (5) five pGEX-2Timportin fusion proteins were successfully expressed and purified by GST-pull down assay. It was found that VP2 could bind to importin 偽 1 importin 偽 3 and be transported into the nucleus to play its physiological and biochemical role. Conclusion: 1. The prokaryotic expression vector of pET-32a ()-Vp2 was successfully constructed, and VP2 fusion protein was successfully expressed and purified under the induction of IPTG. This made a material preparation for the preparation of antibodies and the study of the interaction between VP2 protein and other proteins. 2. 2. BALB/c mice were immunized with VP2 protein, and high titer and specificity of anti VP2 polyclonal antibodies were prepared. This laid a foundation for the detection of VP2 antigen and immunohistochemistry. The nuclear localization signal of VP2 was successfully identified. Four pEGFP-C1-Vp2 green fluorescent vectors were constructed and transfected into 7402 cell line by liposome. The subcellular localization of pEGFP-C1-Vp2 truncated bodies was observed under fluorescence microscope. This is the first time to identify the nuclear localization signal of VP2, which provides information for further research. By GST-pull down method, we successfully identified the nuclear transport receptor of VP2 as importin 偽 1 importin 偽 3. The translocation receptors involved in the process of VP2 nucleation were preliminarily elucidated.
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：2243756