【摘要】： 慢性肝臟疾病是一類世界性的嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病,其中肝纖維化是這個(gè)過(guò)程的中間及關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)是啟動(dòng)整個(gè)事件的開端,在肝纖維化過(guò)程中扮演著重要的角色,誘導(dǎo)活化HSC的凋亡可使肝纖維化發(fā)生逆轉(zhuǎn)。越來(lái)越多的研究認(rèn)為HSC活化和增殖與其凋亡受到抑制有關(guān),而核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。NF-κB是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子κB序列特異結(jié)合的蛋白因子,由Rel蛋白家族的成員以同源或異源二聚體形式組成,目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物的Rel蛋白包括p65 (RelA, NF-κB3)、p50 (NF-κB1)、Rel (c-Rel)、RelB和p52 (NF-κB2),其中p65/p50是發(fā)現(xiàn)最早的,分布最廣泛,主要發(fā)揮生理作用的NF-κB。NF-κB能與多種細(xì)胞基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列特定位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和表達(dá),與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答以及細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的病理生理過(guò)程密切相關(guān)。近年RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)的出現(xiàn)為抑制NF-κB的基因表達(dá)開辟了新的途徑。RNA干擾是指將與內(nèi)源性mRNA互補(bǔ)的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞后,引起該mRNA特異性降解,導(dǎo)致mRNA編碼的基因不能表達(dá),發(fā)生基因沉默,提示我們可以通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默NF-κB的基因表達(dá),從而使HSC的凋亡增加,減緩肝纖維化的進(jìn)程。 目的:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)短發(fā)夾狀干擾RNA(short hairpin RNA, shRNA)對(duì)NF-κBp65進(jìn)行基因干擾,研究其對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)激活的肝星狀細(xì)胞凋亡的影響。 方法:體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞,進(jìn)行以下分組:①空白對(duì)照組;②LPS組:經(jīng)LPS處理;③陰性組:經(jīng)陰性干擾RNA與LPS處理;④陽(yáng)性組:經(jīng)NF-κBp65 shRNA與LPS處理;⑤脂質(zhì)體2000組:經(jīng)脂質(zhì)體2000與LPS處理。應(yīng)用western blot檢測(cè)其NF-κBp65、p50及IκBα的蛋白表達(dá),反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測(cè)NF-κBp65與Ⅰ型前膠原mRNA的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)、末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標(biāo)記法( terminal deoxynucleotidy1 transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化,酶譜法測(cè)定明膠酶活性。 結(jié)果: 1 siRNA轉(zhuǎn)染HSC的效率: 將熒光素標(biāo)記的對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染HSC,通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果顯示33nmol/LsiRNA組轉(zhuǎn)染72小時(shí)效率最高,可達(dá)90%以上。 2 LPS激活HSC后細(xì)胞核中NF-κBp65蛋白的表達(dá): western blot結(jié)果顯示同一濃度的LPS激活HSC后,HSC細(xì)胞核中NF-κBp65蛋白表達(dá)增加,于1小時(shí)細(xì)胞核中NF-κBp65蛋白表達(dá)最高,并且濃度為1000ng/mlLPS激活HSC1小時(shí)后表達(dá)NF-κBp65蛋白增加(232.15%±5.28%)比100ng/mlLPS激活HSC后表達(dá)NF-κBp65蛋白增加(168.18%±3.39%)明顯。 3 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC后細(xì)胞核中NF-κBp65蛋白及mRNA的表達(dá)減低: western blot結(jié)果顯示陽(yáng)性組HSC細(xì)胞核中NF-κBp65蛋白的表達(dá)減低,24小時(shí)比LPS組減低72.41%±1.22%,48小時(shí)減低77.45%±1.23%,72小時(shí)減低86.34%±1.01%,于72小時(shí)減低最高,而陰性組及脂質(zhì)體2000組與LPS組比較無(wú)明顯減低。RT-PCR結(jié)果顯示,陽(yáng)性組NF-κBp65 mRNA表達(dá)明顯減低,而陰性組及脂質(zhì)體2000組與LPS組比較無(wú)明顯減低。此結(jié)果說(shuō)明實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了針對(duì)大鼠HSC的NF-κBp65 mRNA靶序列1543 1561的陽(yáng)性shRNA,將其轉(zhuǎn)染HSC有效地干擾了NF-κBp65的mRNA及蛋白發(fā)達(dá),并于72小時(shí)干擾效率達(dá)到最高。 4 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC72小時(shí)后NF-κBp50和IκBα蛋白表達(dá)減低: western blot結(jié)果顯示經(jīng)陽(yáng)性組HSC細(xì)胞核中NF-κBp50蛋白的表達(dá)減低,比LPS組減低75.45%±0.93%,而陰性組及脂質(zhì)體2000組與LPS組比較無(wú)明顯減低。陽(yáng)性組細(xì)胞漿中IκBα蛋白減低,比LPS組減低70.61%±2.19%,而陰性組及脂質(zhì)體2000組與LPS組比較無(wú)明顯減低,說(shuō)明NF-κBp65 shRNA轉(zhuǎn)染HSC后,干擾NF-κBp65的mRNA及蛋白發(fā)達(dá)的同時(shí),NF-κBp50及IκBα蛋白表達(dá)隨之降低。 5 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC后HSC凋亡增加: 流式細(xì)胞法結(jié)果顯示陽(yáng)性組細(xì)胞凋亡較LPS組增加,凋亡率為15.40%±0.72%,而陰性組及脂質(zhì)體2000組與LPS組比較無(wú)明顯增加。TUNEL法結(jié)果顯示經(jīng)陽(yáng)性組HSC凋亡較LPS組增加,凋亡率為33.33%±1.06%,而陰性組及脂質(zhì)體2000組與LPS組比較無(wú)明顯增加。 6 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC后Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)減低: RT-PCR結(jié)果顯示,經(jīng)陽(yáng)性組Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)明顯減低,較LPS組減低56.84%±1.89%,而陰性組及脂質(zhì)體2000組與LPS組比較無(wú)明顯減低,表明經(jīng)NF-κBp65 shRNA基因干擾后Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)減低。 7 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC后明膠酶活性增高: 酶譜法測(cè)定結(jié)果顯示,陽(yáng)性組明膠酶活性明顯升高,陰性組及脂質(zhì)體2000組與LPS組比較無(wú)明顯變化。 結(jié)論: 1本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了針對(duì)HSC的NF-κBp65 mRNA靶序列1543 1561的陽(yáng)性shRNA,將其轉(zhuǎn)染HSC,有效地干擾了NF-κBp65的基因發(fā)達(dá),與此同時(shí),NF-κB p50及IκBα蛋白表達(dá)減低。 2 LPS可激活HSC中NF-κBp65的表達(dá),使其蛋白表達(dá)增多。 3抑制NF-κBp65的基因發(fā)達(dá)可促進(jìn)HSC的凋亡,同時(shí)Ⅰ型前膠原合成減少,明膠酶活性增強(qiáng),延緩肝纖維化的發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R575.2;R346

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2241570