發(fā)布時間：2018-09-13 15:25

【摘要】： 慢性肝臟疾病是一類世界性的嚴重危害人類健康的主要疾病,其中肝纖維化是這個過程的中間及關鍵環(huán)節(jié)。肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)是啟動整個事件的開端,在肝纖維化過程中扮演著重要的角色,誘導活化HSC的凋亡可使肝纖維化發(fā)生逆轉。越來越多的研究認為HSC活化和增殖與其凋亡受到抑制有關,而核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)與細胞凋亡關系密切。NF-κB是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子κB序列特異結合的蛋白因子,由Rel蛋白家族的成員以同源或異源二聚體形式組成,目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動物的Rel蛋白包括p65 (RelA, NF-κB3)、p50 (NF-κB1)、Rel (c-Rel)、RelB和p52 (NF-κB2),其中p65/p50是發(fā)現(xiàn)最早的,分布最廣泛,主要發(fā)揮生理作用的NF-κB。NF-κB能與多種細胞基因啟動子或增強子序列特定位點發(fā)生特異性結合而促進轉錄和表達,與炎癥反應、免疫應答以及細胞的增生、轉化和凋亡等重要的病理生理過程密切相關。近年RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術的出現(xiàn)為抑制NF-κB的基因表達開辟了新的途徑。RNA干擾是指將與內源性mRNA互補的雙鏈RNA導入細胞后,引起該mRNA特異性降解,導致mRNA編碼的基因不能表達,發(fā)生基因沉默,提示我們可以通過RNA干擾技術沉默NF-κB的基因表達,從而使HSC的凋亡增加,減緩肝纖維化的進程。 目的:本實驗通過設計短發(fā)夾狀干擾RNA(short hairpin RNA, shRNA)對NF-κBp65進行基因干擾,研究其對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)激活的肝星狀細胞凋亡的影響。 方法:體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞,進行以下分組:①空白對照組;②LPS組:經LPS處理;③陰性組:經陰性干擾RNA與LPS處理;④陽性組:經NF-κBp65 shRNA與LPS處理;⑤脂質體2000組:經脂質體2000與LPS處理。應用western blot檢測其NF-κBp65、p50及IκBα的蛋白表達,反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測NF-κBp65與Ⅰ型前膠原mRNA的表達,流式細胞術、末段脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標記法( terminal deoxynucleotidy1 transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)檢測細胞凋亡的變化,酶譜法測定明膠酶活性。 結果: 1 siRNA轉染HSC的效率: 將熒光素標記的對照siRNA轉染HSC,通過熒光顯微鏡觀察轉染效率,結果顯示33nmol/LsiRNA組轉染72小時效率最高,可達90%以上。 2 LPS激活HSC后細胞核中NF-κBp65蛋白的表達: western blot結果顯示同一濃度的LPS激活HSC后,HSC細胞核中NF-κBp65蛋白表達增加,于1小時細胞核中NF-κBp65蛋白表達最高,并且濃度為1000ng/mlLPS激活HSC1小時后表達NF-κBp65蛋白增加(232.15%±5.28%)比100ng/mlLPS激活HSC后表達NF-κBp65蛋白增加(168.18%±3.39%)明顯。 3 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC后細胞核中NF-κBp65蛋白及mRNA的表達減低: western blot結果顯示陽性組HSC細胞核中NF-κBp65蛋白的表達減低,24小時比LPS組減低72.41%±1.22%,48小時減低77.45%±1.23%,72小時減低86.34%±1.01%,于72小時減低最高,而陰性組及脂質體2000組與LPS組比較無明顯減低。RT-PCR結果顯示,陽性組NF-κBp65 mRNA表達明顯減低,而陰性組及脂質體2000組與LPS組比較無明顯減低。此結果說明實驗構建了針對大鼠HSC的NF-κBp65 mRNA靶序列1543 1561的陽性shRNA,將其轉染HSC有效地干擾了NF-κBp65的mRNA及蛋白發(fā)達,并于72小時干擾效率達到最高。 4 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC72小時后NF-κBp50和IκBα蛋白表達減低: western blot結果顯示經陽性組HSC細胞核中NF-κBp50蛋白的表達減低,比LPS組減低75.45%±0.93%,而陰性組及脂質體2000組與LPS組比較無明顯減低。陽性組細胞漿中IκBα蛋白減低,比LPS組減低70.61%±2.19%,而陰性組及脂質體2000組與LPS組比較無明顯減低,說明NF-κBp65 shRNA轉染HSC后,干擾NF-κBp65的mRNA及蛋白發(fā)達的同時,NF-κBp50及IκBα蛋白表達隨之降低。 5 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC后HSC凋亡增加: 流式細胞法結果顯示陽性組細胞凋亡較LPS組增加,凋亡率為15.40%±0.72%,而陰性組及脂質體2000組與LPS組比較無明顯增加。TUNEL法結果顯示經陽性組HSC凋亡較LPS組增加,凋亡率為33.33%±1.06%,而陰性組及脂質體2000組與LPS組比較無明顯增加。 6 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC后Ⅰ型前膠原mRNA表達減低: RT-PCR結果顯示,經陽性組Ⅰ型前膠原mRNA表達明顯減低,較LPS組減低56.84%±1.89%,而陰性組及脂質體2000組與LPS組比較無明顯減低,表明經NF-κBp65 shRNA基因干擾后Ⅰ型前膠原mRNA表達減低。 7 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC后明膠酶活性增高: 酶譜法測定結果顯示,陽性組明膠酶活性明顯升高,陰性組及脂質體2000組與LPS組比較無明顯變化。 結論: 1本實驗構建了針對HSC的NF-κBp65 mRNA靶序列1543 1561的陽性shRNA,將其轉染HSC,有效地干擾了NF-κBp65的基因發(fā)達,與此同時,NF-κB p50及IκBα蛋白表達減低。 2 LPS可激活HSC中NF-κBp65的表達,使其蛋白表達增多。 3抑制NF-κBp65的基因發(fā)達可促進HSC的凋亡,同時Ⅰ型前膠原合成減少,明膠酶活性增強,延緩肝纖維化的發(fā)展。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R575.2;R346

【共引文獻】

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本文編號：2241570