【摘要】： 目的(1)應(yīng)用改良及傳統(tǒng)培養(yǎng)方法體外培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs),觀察其生物學(xué)特性,為下一步角膜后板層重建奠定基礎(chǔ)。(2)探討以板層豬角膜基質(zhì)后彈力層面為載體培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞初步構(gòu)建組織工程角膜后板層的可行性,為組織工程角膜后板層的構(gòu)建提供新的種子細(xì)胞來(lái)源和適宜的載體材料。 方法(1)采用新培養(yǎng)法—懸浮基質(zhì)片法及傳統(tǒng)方法對(duì)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)及鑒定。(2)采用新培養(yǎng)法—臍帶組織片懸浮法及傳統(tǒng)方法對(duì)人臍帶MSCs進(jìn)行分離、純化、擴(kuò)增、傳代,觀察其體外生長(zhǎng)特征。(3)采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)體外培養(yǎng)的人臍帶MSCs進(jìn)行免疫表型鑒定,并行成脂細(xì)胞和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化,鑒定其干細(xì)胞特性。(4)將第五代臍帶MSCs接種于去除內(nèi)皮細(xì)胞的板層豬角膜基質(zhì)后彈力層面上進(jìn)行培養(yǎng)。(5)待細(xì)胞融合形成單層后,觀察接種后細(xì)胞的生長(zhǎng)特性,3周后行HE染色及掃描電鏡、透射電鏡等對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。免疫組化法檢測(cè)接種后干細(xì)胞角膜內(nèi)皮細(xì)胞抗原標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的表達(dá)。 結(jié)果(1)新的培養(yǎng)方法—懸浮基質(zhì)片法及臍帶組織片懸浮法可成功培養(yǎng)出角膜基質(zhì)細(xì)胞及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,較傳統(tǒng)方法便捷、可靠。體外培養(yǎng)的角膜基質(zhì)細(xì)胞及臍帶MSCs均呈成纖維細(xì)胞形態(tài),增殖活力好。(2)流式細(xì)胞儀示：培養(yǎng)的人臍帶MSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的特異標(biāo)記包括CD13、CD29、CD44、CD105,但不表達(dá)造血和內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志CD31、CD34、CD45。經(jīng)體外誘導(dǎo)證實(shí),人臍帶MSCs具有向脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞方向分化的能力。(3)將傳代后的人臍帶MSCs接種于板層豬角膜基質(zhì)后彈力層面上進(jìn)行培養(yǎng),細(xì)胞可在后彈力層面貼附,單層生長(zhǎng)良好；電鏡下見(jiàn)細(xì)胞表面微絨毛豐富,細(xì)胞之間緊密連接,富含細(xì)胞器。經(jīng)培養(yǎng)3周后部分干細(xì)胞表達(dá)角膜內(nèi)皮細(xì)胞抗原標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)。 結(jié)論(1)本研究探討了兔角膜基質(zhì)細(xì)胞和人臍帶MSCs體外分離、培養(yǎng)的改良方法,體外培養(yǎng)的角膜基質(zhì)細(xì)胞和臍帶MSCs均呈成纖維細(xì)胞形態(tài),具有較強(qiáng)增殖能力。(2)體外培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,具有多向分化潛能。以板層豬角膜基質(zhì)后彈力層面為載體可成功培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,構(gòu)建出與正常角膜后板層相似的組織,有望為組織工程角膜后板層重建提供一種新的種子細(xì)胞來(lái)源和適宜的載體材料,并為進(jìn)一步深入進(jìn)行功能性研究和移植提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective (1) to observe the biological characteristics of rabbit corneal stromal cells and human umbilical cord mesenchymal stem cells (human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs),) cultured in vitro by modified and traditional methods. (2) to explore the feasibility of using the lamellar layer of porcine corneal stroma as the carrier to culture human umbilical cord mesenchymal stem cells to construct the tissue engineered posterior lamina of cornea. To provide a new seed cell source and suitable carrier material for the construction of the posterior lamina of tissue engineering cornea. Methods (1) the rabbit corneal stromal cells were isolated, cultured and identified by the new culture-suspension matrix method and the traditional method. (2) the human umbilical cord MSCs was isolated, purified and amplified by the new culture-umbilical cord tissue suspension method and the traditional method. (3) Immunophenotypes of human umbilical cord MSCs cultured in vitro were identified by flow cytometry and induced by adipoblasts and osteoblasts. (4) the fifth generation of umbilical cord MSCs was inoculated on the elastic layer of the lamellar porcine corneal stroma to remove endothelial cells. (5) when the cells were fused into monolayers, The growth characteristics of the cells were observed 3 weeks after inoculation. HE staining, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy were used to observe the morphology of the cells. The expression of neuron-specific enolase (NSE) was detected by immunohistochemistry. Results (1) the corneal stromal cells and umbilical cord mesenchymal stem cells could be successfully cultured by a new culture method-suspension matrix method and umbilical cord tissue suspension method, which was more convenient and reliable than the traditional method. Corneal stromal cells and umbilical cord MSCs cultured in vitro showed fibroblast morphology and good proliferative activity. (2) flow cytometry showed that the specific markers of cultured human umbilical cord MSCs expressing mesenchymal stem cells included CD13,CD29,CD44,CD105, but not hematopoietic and endothelial cell markers CD31,CD34,CD45. Human umbilical cord MSCs had the ability to differentiate into adipocytes and osteoblasts by induction in vitro. (3) the cultured human umbilical cord MSCs was cultured on the elastic layer of lamellar porcine corneal stroma, and the cells could be attached to the posterior elastic layer. The growth of monolayer was good. Under electron microscope, the microvilli on the surface of the cells were abundant, the cells were tightly connected and the organelles were rich. After cultured for 3 weeks, some stem cells expressed neuron-specific enolase (NSE). As a marker of corneal endothelial cell antigen. Conclusion (1) the improved method of isolation and culture of rabbit corneal stromal cells and human umbilical cord MSCs in vitro was studied. The corneal stromal cells and umbilical cord MSCs in vitro were fibroblast morphology. (2) cultured human umbilical cord mesenchymal stem cells have the potential of multiple differentiation. Human umbilical cord mesenchymal stem cells could be cultured successfully using the lamellar porcine corneal stromal layer as the carrier, and the tissue similar to the normal corneal posterior lamina could be constructed. It is expected to provide a new source of seed cells and a suitable carrier material for the reconstruction of the posterior lamina of tissue engineering cornea and provide experimental basis for further functional research and transplantation.
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2233476