【摘要】： 目的：中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophils, PMNs)是機體最重要的炎癥細胞,它在機體固有性免疫應答中具有重要作用,其胞漿內富含的細胞毒性物質既可殺傷外來入侵的病原微生物,也可造成自身組織細胞的損傷。研究表明,中性粒細胞粘附、活化及凋亡的整個過程可受Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)的調節(jié),促成炎癥反應的無損傷性收斂,使機體維持內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。其中,TLR4是人們最早發(fā)現(xiàn)的能夠直接介導機體與病原體反應的Toll樣受體。最近,日本科學家發(fā)現(xiàn)一種與中性粒細胞的趨化有關的蛋白DOCK2 (Dedicator of cytokinesis 2),其聚集到中性粒細胞內朝著感染源的一側,使中性粒細胞改變自身形態(tài),更高效地向感染源移動。本課題主要探討DOCK2與中性粒細胞凋亡的相關性以及DOCK2與中性粒細胞上表達的TLR4之間的聯(lián)系。這為今后更深入研究中性粒細胞抗感染能力的機制提供了潛在的依據(jù),也為臨床上治療炎癥性相關疾病提供了新的靶點。方法：抽取健康成人外周靜脈血,Ficoll密度梯度法分離、純化中性粒細胞,并利用臺盼藍拒染試驗、懷特-姬姆薩混合染色法鑒定細胞活力與純度均達96%以上,按實驗需求構建不同的實驗模型：實驗組(DOCK-2刺激組)、陽性對照組(IL-1β刺激組、TNF-α刺激組)、陰性對照組(空白組)。運用光學顯微鏡觀察不同培養(yǎng)狀態(tài)下的細胞形態(tài)；用流式細胞術檢測不同組中性粒細胞的凋亡率；通過反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術檢測TLR4mRNA在各組中的表達情況；免疫印跡(western blotting)技術檢測各組中TLR4的表達情況。結果：1.運用流式細胞術檢測DOCK2對PMNs凋亡是否有影響,結果顯示：與空白組比較,DOCK2組PMN凋亡率是下降的,具有明顯的差異性(P0.05)。2.RT-PCR技術檢測PMNs在不同藥物刺激組中TLR4 mRNA的表達情況。結果顯示：同空白組相比,DOCK2組TLR4 mRNA的表達上調,且有明顯的差異性(P0.01)。3.培養(yǎng)6 h后,將各組模型組中的中性粒細胞裂解,提取總蛋白進行SDS-PAGE并相互比較。結果顯示：在不同刺激物刺激下,中性粒細胞上TLR4蛋白質表達的性質和數(shù)量發(fā)生了不同程度的改變。4.不同實驗組刺激PMN 6 h后,提取蛋白并用Western blotting檢測TLR4蛋白的表達。結果顯示：同空白組相比,DOCK2組TLR4蛋白的表達是上調的,有明顯的差異性(P0.01)。 結論：1.DOCK2可能對PMNs的凋亡有延遲作用。2.DOCK2可能對中性粒細胞上TLR4的表達有上調作用。3.TLR4可能抑制PMN的凋亡。4.DOCK2抑制PMNs凋亡的同時上調TLR4的表達。但也可能前者引起后者,或者后者引起前者。并且,二者變化的量之間可能存在一定的關系。
[Abstract]:Objective: neutrophil (polymorphonuclear neutrophils, PMNs) is the most important inflammatory cell in the body. It plays an important role in the innate immune response of the body. The cytotoxic substances abundant in the cytoplasm of neutrophil (polymorphonuclear neutrophils, PMNs) can kill the invading pathogenic microorganisms. They can also cause damage to their own tissues and cells. The study shows that the whole process of neutrophil adhesion activation and apoptosis can be regulated by Toll like receptor (Toll-like receptors, TLRs) which can promote the noninvasive convergence of inflammatory response and make the body maintain the homeostasis of the internal environment. TLR4 is the first Toll-like receptor that can directly mediate the reaction between organism and pathogen. Recently, Japanese scientists have discovered a protein DOCK2 (Dedicator of cytokinesis 2 associated with neutrophil chemotaxis, which gathers to the side of the neutrophil towards the source of infection, causing the neutrophil to change its morphology and move more efficiently to the source of infection. The purpose of this study was to investigate the relationship between DOCK2 and neutrophil apoptosis and the relationship between DOCK2 and TLR4 expressed on neutrophils. This provides a potential basis for the further study of the mechanism of neutrophil anti-infection, and provides a new target for clinical treatment of inflammatory diseases. Methods: neutrophils were isolated and purified by Ficoll density gradient method from peripheral venous blood of healthy adults. The viability and purity of neutrophils were identified by trypan blue exclusion assay and White-Giemsa mixed staining method. Different experimental models were constructed according to experimental demands: experimental group (DOCK-2 stimulation group), positive control group (IL-1 尾 stimulation group), negative control group (blank group). The apoptosis rate of neutrophils in different groups was detected by flow cytometry and the expression of TLR4mRNA was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Western blot (western blotting) technique was used to detect the expression of TLR4 in each group. The result is 1: 1. The effect of DOCK2 on PMNs apoptosis was detected by flow cytometry. The results showed that the apoptosis rate of PMN in DOCK2 group was lower than that in control group (P0.05). 2. RT-PCR was used to detect the expression of TLR4 mRNA in different drug stimulated groups. The results showed that the expression of TLR4 mRNA was up-regulated, and there was significant difference (P0.01). 3. After 6 hours of culture, the neutrophils in each group were lysed and the total protein was extracted and compared with each other. The results showed that the nature and quantity of TLR4 protein expression on neutrophils changed in varying degrees under different stimuli. After 6 h stimulation of PMN in different experimental groups, the expression of TLR4 protein was detected by Western blotting. The results showed that the expression of TLR4 protein was up-regulated in the control group (P0.01). Conclusion: 1. DOCK2 may delay the apoptosis of PMNs. 2. DOCK2 may up-regulate the expression of TLR4 in neutrophils. 3. TLR4 may inhibit the apoptosis of PMN. 4. DOCK2 inhibits the apoptosis of PMNs and up-regulates the expression of TLR4. But the former may cause the latter, or the latter may cause the former. Moreover, there may be a certain relationship between the quantity of the two changes.
【學位授予單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392.12

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