【摘要】： 背景 miRNA(microRNA)是由約22個(gè)核苷酸組成的單鏈小RNA,并在真核生物細(xì)胞中廣泛存在,miRNA基因約占整個(gè)基因組的1%。近些年來(lái)的各項(xiàng)研究表明miRNA一個(gè)非常龐大的家族,存在于是在植物、線蟲(chóng)、果蠅、小鼠、大鼠和人等多個(gè)物種中。miRNA對(duì)各種進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控是通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平與其靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì),導(dǎo)致mRNA的翻譯、翻譯抑制以及降解。一個(gè)異常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由miRNA與靶mRNA分子組成,參與包括細(xì)胞繁殖與凋亡,細(xì)胞分化與發(fā)育,以及逆境應(yīng)答等多種生物學(xué)過(guò)程。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可具有多向分化潛能,能分化成多種類型的結(jié)締組織,如骨組織、軟骨組織、骨骼肌組織、肌腱組織、韌帶組織、真皮組織、脂肪組織,也可分化成神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)易于在體外擴(kuò)增,來(lái)源又比較廣泛,是目前組織工程中一種重要的種子細(xì)胞。 各種生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、組織分化以及疾病發(fā)生等miRNA均參與調(diào)控,其同時(shí)它眾多生物體發(fā)育和行為等的變化miRNA同樣起著決定作用。在干細(xì)胞增殖以及分化中miRNA的作用及意義這些年來(lái)開(kāi)始受到關(guān)注。在許多種干細(xì)胞中miRNA都有表達(dá),并且通過(guò)調(diào)節(jié)干細(xì)胞中某些關(guān)鍵基因的表達(dá),對(duì)干細(xì)胞的保持自我更新以及多向分化等功能發(fā)揮作用。 目的 通過(guò)檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞中miRNA-210基因的表達(dá)高低,推測(cè)miRNA-210的功能,證明miRNA-210調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化。從而,進(jìn)一步驗(yàn)證了在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化中miRNA的重要作用及意義。 方法 1.對(duì)收集的標(biāo)本中的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采用全骨髓貼壁法(貼壁篩選法)、密度梯度離心法進(jìn)行分離培養(yǎng)。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定是通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)并對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物(CD29、CD44、CD34、CD45)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)來(lái)完成。 2.采用文獻(xiàn)報(bào)道的經(jīng)典的方法:β-甘油磷酸鈉、地塞米松和維生素C聯(lián)合誘導(dǎo)人MSCs向成骨細(xì)胞方向分化。誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞的鑒定是堿性磷酸酶(ALP)染色、茜素紅S法染色來(lái)對(duì)比完成。 3.利用Realtime-PCR觀察對(duì)比miRNA-210在人MSCs與其誘導(dǎo)成的成骨細(xì)胞的差異。 4.采用將miRNA-210模擬物及阻遏物轉(zhuǎn)染至人MSCs中14天后,通過(guò)堿性磷酸酶(ALP)染色、茜素紅S法染色對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 結(jié)果 1.經(jīng)全骨髓貼壁法(貼壁篩選法)及密度梯度離心法分離貼壁培養(yǎng)所得到的細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果為:細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45為陰性,細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44為陽(yáng)性,符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基本特征。 2.采用文獻(xiàn)報(bào)道的經(jīng)典的方法:β-甘油磷酸鈉、地塞米松和維生素C聯(lián)合誘導(dǎo)14天后得到的細(xì)胞:堿性磷酸酶染色(ALP)染色及茜素紅S法染色均為陽(yáng)性,符合成骨細(xì)胞的特征。 3.利用Realtime-PCR觀察與對(duì)比miRNA-210在人MSCs與其誘導(dǎo)成的成骨細(xì)胞的差異。表明miRNA-210在人MSCs中高表達(dá),在誘導(dǎo)成的成骨細(xì)胞低表達(dá)。 4.將miRNA-210模擬物(miRNA-210 mimics)及阻遏物(miRNA-210 inhibitors)轉(zhuǎn)染至人MSCs中14天后,通過(guò)堿性磷酸酶(ALP)染色、茜素紅S法染色對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。轉(zhuǎn)染miRNA-210模擬物的細(xì)胞能夠保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基本特征;而轉(zhuǎn)染miRNA-210阻遏物的細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)染色、茜素紅S法染色均陽(yáng)性。 結(jié)論 1.用全骨髓貼壁法(貼壁篩選法)及密度梯度離心法可以從骨髓中分離得到人MSCs,人MSCs可在體外培養(yǎng)被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。 2.通過(guò)Realtime-PCR的結(jié)果可以推測(cè)miRNA-210具有保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特性的功能。 3.通過(guò)轉(zhuǎn)染miRNA-210模擬物及阻遏物進(jìn)一步證明miRNA-210具有保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特性的功能。
[Abstract]:background
MicroRNA (microRNA) is a single-stranded small RNA composed of about 22 nucleotides and widely exists in eukaryotic cells. The microNA gene accounts for about 1% of the entire genome. Recent studies have shown that microNA is a very large family of plants, nematodes, fruit flies, mice, rats and humans. MicroNA is carried out in a variety of species. Gene expression regulation results in the translation, translation inhibition and degradation of mRNA by complementary pairing with its target mRNA at post-transcriptional level. An unusually complex regulatory network consists of microRNAs and target mRNA molecules involved in a variety of biological processes, including cell proliferation and apoptosis, cell differentiation and development, and stress response.
Bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) can differentiate into many types of connective tissue, such as bone tissue, cartilage tissue, skeletal muscle tissue, tendon tissue, ligament tissue, dermal tissue, adipose tissue, nerve cells and glial cells of the nervous system. Bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) are easy to differentiate into. In vitro expansion is a relatively important source of seed cells in tissue engineering.
MicroRNAs are involved in the regulation of growth and development, signal transduction, tissue differentiation and disease occurrence of various organisms. At the same time, microRNAs play a decisive role in the development and behavior of many other organisms. Both of them are expressed and play an important role in maintaining self-renewal and multidirectional differentiation of stem cells by regulating the expression of some key genes in stem cells.
objective
By detecting the expression of microRNA210 gene in bone marrow mesenchymal stem cells and osteoblasts induced by microRNA210, the function of microRNA210 was speculated, which proved that microRNA210 regulated the osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells.
Method
1. Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured by whole bone marrow adherence (adherence screening) and density gradient centrifugation.
2. Using the classical method reported in the literature, human MSCs were induced to differentiate into osteoblasts by sodium glycerophosphate, dexamethasone and vitamin C. The osteoblasts were identified by alkaline phosphatase (ALP) staining and alizarin red S staining.
3. Realtime-PCR was used to observe and compare the difference between miRNA-210 and MSCs induced osteoblasts.
4. The transfected cells were identified by Alizarin red S staining and alkaline phosphatase (ALP) staining after 14 days of transfection of mimic RNA-210 and repressor into human MSCs.
Result
1. The adherent cells were isolated by whole bone marrow adherent method (adherent screening) and density gradient centrifugation. The results of flow cytometry were as follows: cell surface markers CD34, CD45 were negative, cell surface markers CD29, CD44 were positive, which accorded with the basic characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells.
2. Alkaline phosphatase staining (ALP) and alizarin red S staining were positive in the cells obtained 14 days after induction with beta-glycerophosphate, dexamethasone and vitamin C, which accorded with the characteristics of osteoblasts.
3. Realtime-PCR was used to observe and compare the difference between human MSCs and osteoblasts induced by microRNA-210. The results showed that microRNA-210 was highly expressed in human MSCs and low expressed in induced osteoblasts.
4. Fourteen days after transfection of human MSCs with microRNA210 mimics and microRNA210 inhibitors, the transfected cells were identified by alkaline phosphatase (ALP) staining and alizarin red S staining. Cell alkaline phosphatase (ALP) staining and alizarin red S staining were all positive.
conclusion
1. Human MSCs can be isolated from bone marrow by whole bone marrow adherence screening and density gradient centrifugation. Human MSCs can be induced to differentiate into osteoblasts in vitro.
2. The results of Realtime-PCR suggested that microRNA-210 could maintain the properties of bone marrow mesenchymal stem cells.
3. Transfection of mimics and repressors of microRNA210 further proved that microRNA210 has the function of maintaining the characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells.
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2221269