發(fā)布時間：2018-08-29 09:46

【摘要】：目的構(gòu)建人胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)β亞基胞外結(jié)構(gòu)域(ED)和胞內(nèi)激酶(PKD)結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)載體,獲得純化的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD融合蛋白,并檢測其活性。方法用PCR方法從乳腺cDNA文庫中擴(kuò)增IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因編碼序列,將其正確插入pGEX-KG載體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossate表達(dá)后,用GST-Sepharose 4B珠子純化融合蛋白,并用Western blot法檢測融合蛋白表達(dá),最后用GST pull-down技術(shù)檢測純化蛋白與已知蛋白表皮生長因子受體2驅(qū)動的細(xì)胞運(yùn)動調(diào)節(jié)蛋白(MEMO)的相互作用。結(jié)果構(gòu)建得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因的原核表達(dá)載體,雙酶切鑒定得到與預(yù)期片段大小相符的外源基因插入片段,測序后與目的序列一致;在Rossate菌中誘導(dǎo)表達(dá)出與預(yù)期位置相符的目的蛋白,并經(jīng)過Western blot檢測,融合蛋白成功表達(dá);純化得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD兩個融合蛋白,GST pull-down證明蛋白GST-IGF1Rβ-PKD可以和MEMO相互作用。結(jié)論成功克隆GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因,并獲得活性良好的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD蛋白。
[Abstract]:Objective to construct the prokaryotic expression vector of extracellular domain (ED) and intracellular kinase (PKD) domain of human insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) 尾 subunit, obtain purified GST-IGF1R 尾 -Ed and GST-IGF1R 尾 -PKD fusion protein, and detect their activity. Methods the coding sequences of IGF1R 尾 -Ed and GST-IGF1R 尾 -PKD genes were amplified by PCR from mammary cDNA library and inserted into pGEX-KG vector correctly. After the recombinant plasmid was transformed into E. coli Rossate expression, the fusion protein was purified by GST-Sepharose 4B beads, and the fusion protein was detected by Western blot method. Finally, the interaction of purified protein with known epidermal growth factor receptor 2 (EGF 2) driven cell motility regulatory protein (MEMO) was detected by GST pull-down technique. Results the prokaryotic expression vectors of GST-IGF1R 尾 -Ed and GST-IGF1R 尾 -PKD genes were constructed and identified by double enzyme digestion. The fusion protein was successfully expressed by Western blot, and the two fusion proteins GST-IGF1R 尾 -Ed and GST-IGF1R 尾 -PKD were purified, which proved that GST-IGF1R 尾 -PKD could interact with MEMO. Conclusion GST-IGF1R 尾 -Ed and GST-IGF1R 尾 -PKD genes were cloned successfully and GST-IGF1R 尾 -Ed and GST-IGF1R 尾 -PKD proteins were obtained.
【作者單位】： 大連醫(yī)科大學(xué)生物工程研究所;軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所;第二炮兵總醫(yī)院;軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院科技部;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(81472589,31100604) 北京市科技新星計劃(Z141102001814055) 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院創(chuàng)新基金轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)項目(ZHYX003) 北京市自然科學(xué)基金(7132155)
【分類號】：R392-33

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2210828