【摘要】： 肺炎衣原體是一類嚴格的活細胞內(nèi)寄生的、具有獨特生活周期的微生物。其復制和生物合成是在被感染的宿主細胞內(nèi)形成的包涵體中進行的,因此包涵體是衣原體賴以生存和繁殖的微環(huán)境,為了建立和維持衣原體在感染細胞包涵體內(nèi)的生長,就必須通過包涵體膜與宿主細胞進行物質和信號的交換。自從1995年Rochey等用實驗首次證實衣原體通過自身表達的蛋白而主動修飾包涵體膜以來,陸續(xù)有新的包涵體膜蛋白被鑒定出來,并對部分包涵體膜蛋白的生物學作用進行了研究,初步顯示包涵體膜蛋白參與與宿主間的相互作用及其致病性。 由于包涵體膜蛋白在研究衣原體中發(fā)育以及致病過程中的重要地位,尋找并探究包涵體膜蛋白的生物學作用成為研究的熱點之一。根據(jù)已經(jīng)鑒定的膜蛋白的疏水性特征,計算機輔助程序預測出90個肺炎衣原體(CPn)基因編碼的蛋白為候選包涵體膜蛋白,但目前通過直接抗體標記檢測證實的包涵體膜蛋白為數(shù)不多。已有的發(fā)現(xiàn)提示并非所有計算機預測的包涵體膜蛋白均位于包涵體膜上。因此使用試驗方法發(fā)現(xiàn)和確認假定的包涵體膜蛋白并進一步探討其特性對深入了解衣原體的生物學作用、致病性以及預防具有重要意義。 CPn0308是預測的包涵體膜蛋白,是否定位于包涵體膜上尚有待于進一步確認。為此本研究在檢索CPn基因庫信息的基礎上,分析CPn0308及其相關基因的特性;克隆CPn0308及其相關基因并表達其GST融合蛋白;制備多克隆和單克隆抗體,對內(nèi)源性蛋白的表達進行定位;在定位的基礎上對其特性進一步研究,以期為更全面了解衣原體包涵體膜蛋白的生物學作用提供信息。 第一部分CPn0308及其相關基因的克隆與表達 目的:分析和克隆CPn0308和與其相關的其他衣原體基因(包括CT249、MoPn052和GPIC0474)的基礎上,進一步表達相關的蛋白,為后續(xù)制備抗體、鑒定包涵體膜蛋白奠定基礎。 方法:①依據(jù)文獻提供的信息,檢索CPn0308信息,根據(jù)檢索提示,進行相關分析。②選擇肺炎衣原體CPn0308基因的開放讀碼框架區(qū)的基因和相關基因CT249、MoPn0520、GPIC0474以及所用的克隆和表達載體pGEX-6P2設計引物;采用PCR方法獲取目的基因。③采用常規(guī)的酚-氯仿法提純擴增的目的基因,進行限制性內(nèi)切酶酶切處理。④用T4連接酶連接純化后的消化產(chǎn)物與預處理的pGEX-6P2載體,然后轉化感受態(tài)細胞XL1-blue,接種在含有100μg/ml AMP的選擇性培養(yǎng)基LB平板上,37℃過夜培養(yǎng)。⑤采用針對pGEX-6P2載體的PCR初步篩選選擇性培養(yǎng)基上生長的克隆;對PCR擴增陽性的克隆提取質粒,進一步采用交叉-PCR進行鑒定;交叉PCR擴增陽性的質粒進行測序并進行序列分析。⑥用IPTG誘導序列正確的克隆表達GST重組蛋白,用Glutathione Sepharose TM 4B純化重組蛋白,SDS-PAGE凝膠電泳鑒定。 結果:①CPn0308基因長度為366bps,編碼121個氨基酸殘基,分子量為12.971kDa。CT249、GPIC0474和MoPn0520在基因結構與CPn0308具有相似性。一個基因獨自為一個基因群,兩側均為已知的基因glgP和dnaA,編碼的氨基酸殘基數(shù)相似。②獲得了載體重組質粒pGEX-6P2/CPn0308、pGEX-6P2/CT249、pGEX-6P2/MoPn0520和pGEX-6P2 /GPIC0474。經(jīng)過用針對pGEX-6P2載體的引物初步篩選后進一步提取重組質粒,經(jīng)過pGEX-6P2的引物和特異性引物進行交叉PCR擴增,獲得的擴增產(chǎn)物與預期結果一致。直接以重組質粒pGEX-6P2/CPn0308、pGEX- 6P2/CT249、pGEX-6P2/MoPn0520和pGEX-6P2/GPIC0474為模板進行測序,得到克隆片段的DNA序列,與基因庫中的序列比對的一致性均為100%,進一步分析發(fā)現(xiàn)均含有兩個跨膜區(qū)域。③選取陽性克隆誘導表達重組蛋白,經(jīng)過純化后進行SDS-PAGE電泳,顯示條帶與預期結果一致。 結論:①CPn0308及其相關的CT249、MoPn0520以及GPIC 0474基因結構相似。②成功地將CPn0308以及CT249、MoPn0520和GPIC0474克隆到pGEX-6P2載體中,并表達出GST-CPn0308等四個GST融合蛋白。 第二部分CPn0308、CT249、MoPn0520和GPIC0474抗體制備及應用 目的:本研究在第一部分克隆、表達蛋白基礎上進一步制備CPn0308及其相關蛋白的多克隆抗體以及CPn0308的單克隆抗體;采用抗體標記檢測法對四種內(nèi)源性蛋白進行初步定位分析,以期為深入探究這些假定蛋白的生物學作用奠定基礎。 方法:①用Glutathione Sepharose TM 4B純化融合蛋白GST-CPn 0308、GST-CT249、GST-MoPn0520和GST-GPIC0474作為免疫原,常規(guī)方法免疫Balb/C小鼠,分離血清獲得多克隆抗體。對GST-CPn0308蛋白,常規(guī)方法制備單克隆抗體。②采用IFA進行篩選陽性克隆和效價滴定。③用IFA方法對所獲取的單克隆抗體進行類別的鑒定;應用Western Blotting技術進行檢測抗體所識別的CPn0308的部位特異性和識別部位的鑒定。④用所制備的抗體進行不同組合的IFA對四種抗體所對應的內(nèi)源性蛋白進行初步定位。進一步用吸附試驗和抗GST-CPn0308的多克隆抗體直接對四個不同種屬的衣原體(AR39、L2、MoPn和GPIC)感染后的HeLa細胞進行IFA分析CPn0308與其他三個蛋白的同源性。 結果:①IFA測試血清的效價如下:CPn0308、MoPn0520、CT249和GPIC0474分別為1:2000、1:200、1:2000和1:200。②制備CPn0308的單克隆抗體獲得四株陽性雜交瘤細胞株,分別命名為2D7、3A6、3H5、5E10;單克隆抗體均為IgG類抗體,其中2D7為IgG3亞類、3A6為IgG1亞類、3H5和5E10均為IgG2b亞類;四株單克隆抗體識別CPn0308的部位均為CPn0308N,即靠近氨基端一側。③IFA結果顯示假定衣原體蛋白CPn0308、CT249和MoPn0520位于包涵體膜上,即包涵體膜蛋白,而GPIC0474則不位于包涵體膜上。④與對照比較,用GST-CPn0308蛋白吸附GST-CPn0308的抗體未見包涵體膜蛋白的染色,而用GST-CT249、GST-MoPn0520和GST-GPIC0474吸附后仍然可見GST-CPn0308的抗體的特異性包涵體膜蛋白的染色。用GST-CPn0308的多克隆抗體直接對不同種屬的衣原體感染的HeLa進行抗體染色,GST-CPn0308的多克隆抗體只識別AR39感染所形成的包涵體膜蛋白,而不識別其他三種衣原體感染所形成的包涵體膜及其包涵體內(nèi)的衣原體。 結論:①成功制備出四株CPn0308的單克隆抗體(2D7、3A6、3H5和5E10),均為IgG類,識別CPn0308的氨基端。②用多克隆抗體對相應的蛋白進行定位,假定蛋白CPn0308、CT249、MoPn0520位于各自衣原體感染HeLa細胞形成的包涵體膜上,而假定蛋白GPIC0474則不在包涵體膜上。③試驗證實CPn0308與CT249、MoPn0520以及GPIC0474沒有同源性。 第三部分假定蛋白CPn0308特性的初步研究 目的:使用抗體標記技術對假定蛋白CPn0308進行鑒定,并對其特性進行初步研究。 方法:①用含有R12AR39和CPn0308的多克隆抗體或單克隆抗體作一抗進行IFA,在熒光顯微鏡下觀察假定蛋白CPn0308在感染細胞內(nèi)的初步定位。②選用已經(jīng)鑒定的CPn蛋白CPAFcp、IncA、MOMP和HSP60分別與CPn0308進行共染色。在激光共聚焦顯微鏡下觀察目的蛋白CPn0308與其他參照蛋白的定位情況。③使用脂質體2000轉染試劑分別轉染重組體pDsRed-C1/CPn0308和pDsRed-C1/CPn0186到HeLa細胞,在熒光顯微鏡下觀察CPn0308抗體的染色特性;通過吸附試驗觀察CPn0308抗體和IncA抗體對包涵體膜蛋白染色的特異性;采用Western Blotting技術檢測CPn0308抗體結合內(nèi)源性以及外源性蛋白的特異性。④分別在AR39感染HeLa細胞后的不同時間點進行IFA實驗,觀察內(nèi)源性CPn0308蛋白的表達時相。 結果:①使用融合蛋白GST-CPn0308的多克隆抗體和單克隆抗體檢測目的蛋白顯示初步定位于包涵體膜上。②選擇CPn0308的單克隆抗體與參照蛋白CPAFcp、IncA、MOMP和HSP60進行共染色,所檢測到信號表明CPn0308與CPAFcp、MOMP和HSP60沒有交叉現(xiàn)象,與IncA有重疊現(xiàn)象,均位于細胞膜上,重疊部分的顏色為黃色。進一步使用激光共聚焦顯微鏡對CPn0308在包涵體膜上的定位,發(fā)現(xiàn)CPn0308的存在模式明顯不同于CPAFcp、MOMP和HSP60的模式,染色結果顯示綠、紅、藍三種顏色。但與IncA有重疊現(xiàn)象,顏色顯示為藍、黃兩種顏色。即使從Z軸不同的聚焦點觀察,均有與IncA重疊現(xiàn)象。③當用針對CPn0308的多克隆抗體和單克隆抗體對轉染的細胞進行染色時顯示,pDsRed-C1- CPn0308轉染HeLa細胞內(nèi)表達的蛋白染色為黃色,而pDsRed-C1-CPn 0186轉染HeLa細胞內(nèi)表達的蛋白染色為紅色;當用針對CPn0186的單克隆抗體進行染色時,正好相反。與對照相比較,當CPn0308的抗體用GST-CPn0308預吸附后染色可見抗體檢測信號消失,而用GST-CPn0186預吸附后染色仍然可見;當CPn0186的抗體用GST-CPn0308預吸附后染色可見檢測信號,用GST-CPn0186預吸附后信號消失。與參照抗體檢測信號相比,Western Blotting顯示用CPn0308的抗體只檢測到AR39感染后的HeLa細胞的裂解液和GST-CPn0308有相應的蛋白條帶,而其他泳道沒有可檢測到的蛋白條帶。以上從三個不同的方面證實抗體結合包涵體膜的特異性。④在AR39感染后的不同時間點,進行IFA觀察顯示在感染后24h可明顯觀察到內(nèi)源性的CPn0308蛋白表達在包涵體的膜上,并且 在整個感染期間一直存在包涵體膜上。結論:①用CPn0308的多克隆抗體和單克隆抗體首次試驗證實假定蛋白CPn0308位于CPn感染HeLa細胞形成的包涵體膜上。②共定位發(fā)現(xiàn)CPn 0308在包涵體上分布模式類似于IncA,而不同于參照蛋白CPAFcp、MOMP和HSP60。③CPn0308的表達時相為在感染后24h表達于包涵體膜上,并在后續(xù)的感染期間一直存在包涵體膜上。 第四部分感染肺炎衣原體人群中CPn0308免疫原性的檢測分析目的:在分析缺血性腦血管疾病(ICVD)患者肺炎衣原體感染的基礎上進一步分析CPn0308的免疫原性。 方法:①收集相關的臨床標本,分離血漿和提取外周血中單個核細胞(PBMC)中的DNA。②用肺炎衣原體的IgG和IgM診斷試劑盒檢測血漿中肺炎衣原體的感染情況。③用PCR法檢測分析外周血單個核細胞中肺炎衣原體DNA的存在情況。④用Western Blotting法分析內(nèi)源性蛋白CPn0308的免疫原性。 結果:①在所檢測的70例ICVD標本中,IgG的陽性率為51.43%,與對照比較有統(tǒng)計學意義;IgM的陽性率2.86%;與對照比較,無統(tǒng)計學意義。②ICVD患者CPn DNA的陽性率為81.08%,顯著高于對照組。③當血漿標本按1:500稀釋后,仍可檢測到CPn0308的抗體。當用結合GST-CPn 0308的凝膠微粒(Beads)預吸附可中斷反應,而用GST-CPn0186 Beads預吸附則不能中斷反應,說明反應的特異性。 結論:①ICVD患者CPn IgG的陽性率明顯升高。②ICVD患者PBMC中CPnDNA陽性率顯著升高;檢出率高于EIA法,是一種敏感的檢測CPn感染的檢測方法。③初步分析顯示CPn0308在感染人群中具有一定的免疫原性。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R374

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 賈天軍,李萍,張庶民,張印則,張寅龍,雷殿良;MBL EXON Ⅰ 54位基因突變檢測方法的建立及初步應用[J];中國生物制品學雜志;2003年06期

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本文編號：2202985