發(fā)布時間：2018-08-12 07:35

【摘要】： 當(dāng)人體處于極端環(huán)境和病理生理狀態(tài)下,體內(nèi)的氧化還原平衡被打破,氧化水平升高,可以形成胞內(nèi)局部的氧化脅迫環(huán)境。研究表明一些心肌和骨骼肌疾病都與肌質(zhì)網(wǎng)膜的離子通道的氧化損傷有關(guān)。而肌質(zhì)網(wǎng)肌質(zhì)網(wǎng)(sarcoplasmicreticulum,SR)中的鈣釋放通道(ryanodine receptor,RyR)富含巰基,對氧化還原環(huán)境異常敏感,是氧化脅迫的作用目標(biāo)。前期工作表明,在氧化脅迫條件下RyR被嚴(yán)重抑制,蛋白內(nèi)的自由巰基數(shù)量劇減。鈣釋放通道RyR的功能狀態(tài)與其它膜蛋白和RyR之間的相互作用密切相關(guān),因此,我們選擇蛋白間的相互作用作為主要研究內(nèi)容,初步探討氧化脅迫對RyR的影響如何和造成這種影響的機制。 本研究以氧化脅迫濃度下的Na_2SeO_3和1,4NQ模擬氧化脅迫環(huán)境,以兔骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)(SR)囊泡和鈣釋放通道(RyR1)為研究對象,利用【3H】-ryanodine結(jié)合實驗,SDS-PAGE和Western Blotting,光子相干光譜法(PCS)和DPH熒光偏振法,考察氧化脅迫條件下氧化型通道調(diào)控劑對RyR1通道活性,SR蛋白分布,RyR1顆粒粒徑分布和SR膜流動性的影響。 實驗表明,氧化脅迫濃度的Na_2SeO_3和1,4NQ的預(yù)處理導(dǎo)致了RyR1通道活性和SR膜的流動性降低;并導(dǎo)致了SR膜蛋白交聯(lián),形成大分子交聯(lián)復(fù)合物電泳條帶并被DTT逆轉(zhuǎn);RyR、鈣泵、myosin和鈣結(jié)合蛋白等蛋白參與了復(fù)合物的形成;進而發(fā)現(xiàn),Na_2SeO_3和1,4NQ處理使得RyR蛋白之間形成了大粒徑的聚合物,導(dǎo)致RyR的平均粒徑增大,而DTT也可以部分逆轉(zhuǎn)這種粒徑的增大。 上述結(jié)果顯示,氧化脅迫濃度的氧化劑對RyR1通道的抑制作用,可能是由于氧化了負(fù)責(zé)關(guān)閉通道的職能巰基群,并由此產(chǎn)生了蛋白間錯誤交聯(lián)而形成蛋白異常堆積,因此可能改變了鈣釋放通道的功能結(jié)構(gòu);SR膜流動性的下降,也可能誘導(dǎo)了蛋白和脂質(zhì)分子、以及脂質(zhì)分子間的交聯(lián),由此也可能導(dǎo)致蛋白變構(gòu)的靈活性下降。另外所導(dǎo)致的RyR之間相互連接的增強也可能影響RyR之間的正常的協(xié)同性。
[Abstract]:When the human body is in extreme environment and pathophysiological state, the redox balance is broken and the oxidation level is increased, which can form the local oxidative stress environment in the cell. Studies have shown that some myocardial and skeletal muscle diseases are associated with oxidative damage of ion channels in the sarcoplasmic omentum. The ryanodine receptor RyR in sarcoplasmic reticulum SR, which is rich in sulfhydryl, is sensitive to redox environment and is the target of oxidative stress. Previous work showed that RyR was severely inhibited under oxidative stress, and the number of free sulfhydryl groups in the protein was greatly reduced. The functional state of calcium release channel (RyR) is closely related to the interaction between other membrane proteins and RyR. To explore the effect of oxidative stress on RyR and its mechanism. In this study, (SR) vesicles and calcium release channel (RyR1) of rabbit skeletal muscle reticulum were used to simulate oxidative stress environment under oxidative stress concentration of Na_2SeO_3 and 1nq, and calcium release channel (RyR1) of rabbit skeletal muscle sarcoplasmic reticulum was studied. Using [3H] -ryanodine binding experiment, SDS-PAGE and Western blotting. photonic coherence spectroscopy (PCS) and DPH fluorescence polarization method were used to investigate the effect of oxidation channel regulator on the particle size distribution and SR membrane fluidity of RyR1 channel active SR protein. The results showed that the pretreatment of Na_2SeO_3 and 1NQ under oxidative stress concentration resulted in the decrease of RyR1 channel activity and the fluidity of SR membrane, and the cross-linking of SR membrane protein. The formation of macromolecular cross-linked complex electrophoresis bands was reversed by DTT, and proteins such as calcium pump myosin and calcium-binding protein were involved in the formation of the complex, and it was found that the treatment of Na _ 2SeO _ 3 and 1N _ (4) NQ resulted in the formation of large particle size polymers between RyR proteins. The average particle size of RyR increases, and DTT can partially reverse the increase. These results suggest that the inhibition of oxidant concentration on RyR1 channel may be due to the oxidation of the functional sulfhydryl group responsible for closing the channel and the formation of abnormal protein accumulation as a result of cross-linking between proteins. Therefore, it may change the functional structure of calcium release channel and decrease the fluidity of SR membrane. It may also induce protein and lipid molecules and the cross-linking between lipid molecules, which may lead to the decrease of flexibility of protein structure. The resulting enhancement of RyR interconnections may also affect the normal synergy between RyR.
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R363

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本文編號：2178360