發(fā)布時間：2018-08-11 20:09

【摘要】： CUEDC2 (CUE Domain Containing 2)是一個功能未知的蛋白質(zhì)。最近研究發(fā)現(xiàn)CUEDC2能夠和孕激素受體結(jié)合,促進(jìn)孕激素誘導(dǎo)的受體的泛素化和降解,可能作為一個新的腫瘤治療靶點(diǎn),因而具有十分重要的應(yīng)用價值。為了更好的研究其生物學(xué)功能,我們擬用核磁共振方法研究其三維結(jié)構(gòu)。通過生物信息學(xué)的分析表明CUEDC2包含一個CUE結(jié)構(gòu)域。CUE結(jié)構(gòu)域是一個約40個氨基酸的廣泛存在于真核蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)域。CUE結(jié)構(gòu)域具有多種功能,其中包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上所合成的折疊錯誤和序列錯誤的蛋白質(zhì)的降解過程。CUE結(jié)構(gòu)域有著與UBA結(jié)構(gòu)域相似的結(jié)構(gòu),都有三個α-螺旋折疊而成。CUE結(jié)構(gòu)域的α-螺旋1中的保守的MFP motif和α-螺旋3中的LL motif與泛素的疏水表面相互作用,同時據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道CUE結(jié)構(gòu)域可以形成二聚體,可以附加的結(jié)合多個泛素,因而具有較高的泛素親和能力。許多包含CUE結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)既能識別單泛素化又能識別多泛素化。實(shí)驗(yàn)證明,許多包含CUE結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)都能夠以一種CUE結(jié)構(gòu)域依賴性的方法發(fā)生泛素化。CUEDC2是一個分子量約為32 kDa包含287個氨基酸的酸性蛋白質(zhì)。由于分子量較大,我們計(jì)劃將其截成2個片段,分別解析其溶液結(jié)構(gòu)。 本文以CUEDC2為研究對象,分別構(gòu)建了多個CUEDC2的截?cái)囿w,并通過優(yōu)化各種表達(dá)與純化條件,獲得了高表達(dá)的,且符合核磁共振實(shí)驗(yàn)要求的蛋白質(zhì)樣品溶液,并利用多維核磁共振技術(shù)對CUEDC2 N端包含133個氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步的研究與探索。 首先,我們表達(dá)、純化了GST-CUEDC(1-133),但是在用凝血酶切除GST標(biāo)簽蛋白時,我們發(fā)現(xiàn)在用凝血酶酶切16小時后仍然無法將GST標(biāo)簽蛋白切下。于是我們考慮構(gòu)建有較小的標(biāo)簽的克隆。我們將CUEDC2 N端的133個氨基酸構(gòu)建到pET-28a載體上,并對其表達(dá)、純化條件及蛋白質(zhì)序列進(jìn)行優(yōu)化。最終獲得了折疊狀態(tài)較好的CUEDC(1-133)cut蛋白質(zhì)樣品。之后,我們優(yōu)化了核磁共振的實(shí)驗(yàn)溫度并確定了三共振實(shí)驗(yàn)條件。我們采集了一系列的三維核磁共振實(shí)驗(yàn)圖譜,包括用于主鏈譜峰指認(rèn)的HNCA、HNCOCA、CBCANH、CBCA(CO)NH和用于側(cè)鏈譜峰指認(rèn)的HBHA(CO)NH、CCCONH、15N-NOESY-HSQC、HCCH-COSY和HCCH-TOCSY譜。然后我們利用NMRPipe軟件包對譜圖進(jìn)行處理,利用CARA軟件歸屬了大部分主鏈原子的化學(xué)位移。 本文還對CUEDC2(133-287)蛋白進(jìn)行了初步的研究。表達(dá)、純化了GST-CUEDC(133-287)。并利用凝血酶對GST-CUEDC(133-287)酶切,除去了GST標(biāo)簽蛋白,獲得了高濃度的CUEDC(133-287)蛋白樣品。然后我們1H核磁共振譜對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步的評價。結(jié)果表明可能由于CUEDC2(133-287)這個截?cái)囿w中缺失了某個關(guān)鍵的氨基酸序列,導(dǎo)致其折疊構(gòu)象改變,蛋白質(zhì)折疊不完全。我們希望通過構(gòu)建其它的CUEDC2截?cái)囿w來得到C末端折疊較好的CUEDC2蛋白,進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究。
[Abstract]:CUEDC2 (CUE Domain Containing 2) is an unknown protein. Recently, it has been found that CUEDC2 can bind to progesterone receptor and promote the ubiquification and degradation of progesterone-induced receptors, which may be a new target of tumor therapy, so it has very important application value. In order to better study its biological function, we intend to use nuclear magnetic resonance method to study its three-dimensional structure. Bioinformatics analysis shows that CUEDC2 contains a CUE domain. Cue domain is a domain of about 40 amino acids, which widely exists in eukaryotic proteins. This includes the degradation of proteins synthesized by the endoplasmic reticulum with folding errors and sequence errors. The cue domain has a structure similar to that of the UBA domain. The conserved MFP motif in 偽 -helix 1 and LL motif in 偽 -helix 3 interact with the hydrophobic surface of ubiquitin. It is reported that the CUE domain can form dimers. It can attach multiple ubiquitin, so it has higher Ubiquitin affinity. Many proteins containing CUE domains can recognize both monoubiquitization and polyubiquitin. It has been proved that many proteins containing CUE domain can produce ubiquification in a CUE domain dependent way. CUEDC2 is an acidic protein with a molecular weight of 32 kDa containing 287-amino acids. Due to their high molecular weight, we plan to cut them into two fragments and analyze their solution structures respectively. In this paper, the truncation of CUEDC2 was constructed, and the high expression protein sample solution was obtained by optimizing the expression and purification conditions. The solution structure of 133-amino acid residues at the N-terminal of CUEDC2 was studied by using multi-dimensional NMR technique. First, we expressed and purified GST-CUEDC (1-133), but when we removed the GST tagged protein with thrombin, we found that the GST tag protein could not be removed after 16 hours of thrombin digestion. So we consider building clones with smaller tags. We constructed 133 amino acids from the N-terminal of CUEDC2 into pET-28a vector and optimized their expression, purification conditions and protein sequence. Finally, CUEDC (1-133) cut protein samples with good folding state were obtained. After that, we optimized the experimental temperature of NMR and determined the experimental conditions of triple resonance. We have collected a series of 3D NMR spectra, including HNCAA HNCOCACCAN CBCACA (CO) NH used for the identification of the main chain peaks and HBHA (CO) NH + CCCONHN 15N-NOESY-HSQCU HCCH-COSY and HCCH-TOCSY spectra used to identify the side chain peaks of HCCH-COSY. Then we use the NMRPipe software package to process the spectra and use the CARA software to assign the chemical shifts of most of the main chain atoms. CUEDC2 (133-287) protein was also studied. Expression and purification of GST-CUEDC (133-287). GST-CUEDC (133-287) was digested with thrombin to remove the GST labeled protein, and a high concentration of CUEDC (133-287) protein was obtained. Then our 1H NMR spectra were used to evaluate its structure. The results suggest that the folding conformation of CUEDC2 (133-287) is not complete due to the deletion of a key amino acid sequence in the truncation. We hope to construct other CUEDC2 truncates to obtain a better C-terminal folded CUEDC2 protein and study its structure.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R341

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本文編號：2178107