【摘要】： 【背景與目的】 乙型肝炎是世界各國(guó)尤其是我國(guó)當(dāng)前面臨的重大公共衛(wèi)生問題,因此其傳播途徑,發(fā)病機(jī)制及診療手段的研究一直是各國(guó)政府和科學(xué)家關(guān)注的課題。已有研究證實(shí),乙肝病毒(HBV)基因能夠整合到人精子染色體中,由精子帶入受精卵的HBV基因能夠在早期胚胎細(xì)胞中復(fù)制與表達(dá),但其分子機(jī)制尚不清楚。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾的一個(gè)重要內(nèi)容,在早期胚胎發(fā)育中起重要的調(diào)節(jié)作用。它也是細(xì)胞調(diào)控宿主基因表達(dá)和進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒基因表達(dá)的重要方式。HBV感染可導(dǎo)致宿主細(xì)胞表觀遺傳修飾異常,誘發(fā)染色體不穩(wěn)定,進(jìn)而影響胚胎的正常發(fā)育,整合在宿主基因組中的HBV基因?qū)⒃黾釉l(fā)性肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。本課題的目的是通過研究HBV基因在精子、早期胚胎細(xì)胞中的甲基化狀況,探討它與HBV基因在早期胚胎細(xì)胞中表達(dá)的關(guān)系。 【材料與方法】 (1)材料:①重組質(zhì)粒pBR322-HBV;②6-8周齡雌性金黃地鼠;③人精子由HBsAg陰性的志愿者提供;④甲基化試劑盒(Chemicom公司,S7820);(2)方法:①重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù):用pBR322-HBV轉(zhuǎn)染人精子。②用PCR,斑點(diǎn)雜交技術(shù):證實(shí)轉(zhuǎn)染的人精子中含有HBV DNA。③人精子、金黃地鼠去透明帶卵母細(xì)胞異種體外受精及受精后培養(yǎng)技術(shù):獲得早期胚胎細(xì)胞。④甲基化PCR(MSP)檢測(cè)技術(shù):檢測(cè)HBs和HBx基因啟動(dòng)子在精子和早期胚胎細(xì)胞中的甲基化狀況。⑤甲基化測(cè)序PCR及BLAST分析技術(shù):精確檢測(cè)HBs基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。⑥RT-PCR技術(shù):檢測(cè)胚胎細(xì)胞中HBs和HBx基因的表達(dá)。 【結(jié)果】 ①斑點(diǎn)雜交結(jié)果顯示,用pBR332-HBV轉(zhuǎn)染的人精子經(jīng)6次洗滌后,洗液中已不再有HBV DNA,排除了由于洗液污染給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)的假陽(yáng)性的可能。②PCR結(jié)果表明,精子和早期胚胎細(xì)胞基因組中含有HBV DNA序列。③通過人精子、地鼠去透明帶卵母細(xì)胞異種體外受精及受精后培養(yǎng),獲得了實(shí)驗(yàn)所需的單細(xì)胞胚和2-細(xì)胞胚樣本。④甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)結(jié)果表明,在重組質(zhì)粒pBR332-HBV中,HBs和HBx基因啟動(dòng)子區(qū)是非甲基化的;而在精子基因組中HBs和HBx基因啟動(dòng)子區(qū)已經(jīng)甲基化了;在單細(xì)胞胚和2-細(xì)胞胚基因組中,HBs和HBx基因啟動(dòng)子區(qū)呈去甲基化狀態(tài)。⑤甲基化測(cè)序PCR(BSP)及BLAST分析表明,在精子基因組樣本中可擴(kuò)增出HBs基因啟動(dòng)子區(qū)112 bp的陽(yáng)性條帶,條帶區(qū)域的所有CpG位點(diǎn)呈甲基化狀態(tài)。⑥RT-PCR結(jié)果表明,由精子帶入受精卵的HBs和HBx基因能夠在早期胚胎細(xì)胞中表達(dá)。 【結(jié)論】①HBs和HBx基因啟動(dòng)子區(qū)在重組質(zhì)粒中是非甲基化狀態(tài)。②HBs和HBx基因啟動(dòng)子區(qū)在精子基因組中呈甲基化狀態(tài)。③受精后,HBs和HBx啟動(dòng)子區(qū)在單細(xì)胞胚和2-細(xì)胞胚基因組中呈去甲基化狀態(tài)。④在單細(xì)胞和2-細(xì)胞胚中,由精子帶入的HBs和HBx基因可在mRNA水平表達(dá)。⑤由精子帶入的HBs和HBx基因在早期胚胎細(xì)胞中表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)的去甲基化有關(guān)。
[Abstract]:[background and objective] Hepatitis B is a major public health problem facing countries all over the world, especially in China. The study of pathogenesis and diagnosis and treatment has always been concerned by governments and scientists. It has been proved that (HBV) gene of hepatitis B virus can be integrated into human sperm chromosome, and that HBV gene, which is brought into fertilized egg by sperm, can be duplicated and expressed in early embryonic cells. However, its molecular mechanism is not clear. DNA methylation is an important part of epigenetic modification and plays an important role in the regulation of early embryonic development. It is also an important way for cells to regulate the expression of host genes and viral genes entering into cells. HBV infection may lead to abnormal epigenetic modification of host cells, induce chromosomal instability, and then affect the normal development of embryos. Integration of the HBV gene in the host genome increases the risk of primary liver cancer. The aim of this study was to study the methylation of HBV gene in spermatozoa and early embryonic cells. To investigate the relationship between the expression of HBV gene and the expression of HBV gene in early embryonic cells. [materials and methods] (1) the recombinant plasmid pBR322-HBV1 was provided by HBsAg negative volunteers. 4Methylation Kit (Chemicom Company / S7820); (2) methods: 1: 1 Recombinant plasmid transfection technique: pBR322-HBV was used to transfect human spermatozoa with PCR, dot blot hybridization technique: confirmed that the transfected human spermatozoa contained HBV DNA.3 human spermatozoa. In vitro fertilization and post-fertilization culture of golden hamster without pellucida oocytes: acquisition of 4. 4 methylated PCR (MSP) assay of early embryonic cells: detection of methylation of HBs and HBx gene promoters in spermatozoa and early embryonic cells 5 methylation sequencing PCR and BLAST analysis techniques: accurate detection of methylation status of HBs gene promoter. 6 RT-PCR: detection of HBs and HBx gene expression in embryonic cells. [results] 1the results of dot blot hybridization showed that, Human sperm transfected with pBR332-HBV was washed for 6 times and no HBV was found in the washing solution. The genome of spermatozoa and early embryonic cells contains HBV DNA sequence. 3. 3. Through human spermatozoa, hamster zona-free oocyte xenogeneic fertilization and culture after fertilization, The results of 4-methylation specific PCR (MSP) of single cell embryos and 2-cell embryos were obtained. The results showed that the promoter region of HBs and HBx gene was non-methylated in recombinant plasmid pBR332-HBV. However, the promoter region of HBs and HBx gene has been methylated in spermatozoa, and the promoter region of HBS and HBx gene has been demethylated in the genome of single cell embryo and 2-cell embryo. The results of PCR (BSP) and BLAST analysis show that the promoter region of HBS and HBx gene is demethylated. The positive bands of 112bp in the promoter region of HBs gene could be amplified from the samples of sperm genome. All the CpG sites in the region were methylated by .6RT-PCR. HBs and HBx genes brought into fertilized eggs by spermatozoa can be expressed in early embryonic cells. [conclusion] the promoter region of 1HBs and HBx genes is in the non-methylated state of the recombinant plasmid. 2HBs and HBx gene promoters. The region was methylated in the spermatozoa genome. 3. 3 after fertilization, HBs and HBx promoter regions were demethylated in the single cell embryo and 2 cell embryo genome. 4. 4 in the single cell and 2 cell embryos. HBs and HBx genes brought in by spermatozoa can express 5. 5 HBs and HBx genes brought in by spermatozoa at mRNA level are related to demethylation of promoter region in early embryonic cells.
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R512.62;R346

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本文編號(hào)：2172482