【摘要】： 乙型肝炎病毒(HBV)感染患者自身抗HBV特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)是決定HBV感染自然史和轉(zhuǎn)歸的重要因素之一,探尋有效的免疫調(diào)節(jié)治療手段來激活或增強(qiáng)慢性乙型肝炎(CHB)患者機(jī)體抗HBV特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答,以達(dá)到打破免疫耐受或提高現(xiàn)有抗病毒藥療效的目的,是目前慢性HBV感染防治領(lǐng)域研究熱點(diǎn),將成為今后抗病毒治療策略調(diào)整的趨勢(shì)。 由于抗原的表達(dá)、修飾及合成在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行,并通過MHC-Ⅰ類抗原復(fù)合物方式遞呈,DNA疫苗能更有效誘導(dǎo)機(jī)體特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性。因此,DNA疫苗具有傳統(tǒng)疫苗所不具備的優(yōu)勢(shì),在抗病毒性感染(如HBV、HIV)和腫瘤的基礎(chǔ)及臨床試驗(yàn)中都表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。然而,初步的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明,由HBV包膜中蛋白(PreS2+S)編碼基因構(gòu)建的DNA疫苗治療慢性HBV攜帶者,HBV特異性IFN-γ分泌T淋巴細(xì)胞檢出率及血清HBV DNA水平下降并不非常明顯。影響該項(xiàng)基因治療技術(shù)發(fā)展的最主要的困難是:(1)DNA疫苗質(zhì)粒在宿主體內(nèi)轉(zhuǎn)染率比較低;(2)質(zhì)粒的免疫原性不強(qiáng)。為了解決第一個(gè)問題,我們應(yīng)用了在體電脈沖(EP)技術(shù),成功地提高了HBVDNA疫苗在大體重動(dòng)物比如非人靈長類動(dòng)物中的轉(zhuǎn)染率,并且能有效誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。為解決第二個(gè)技術(shù)難題,我們?cè)O(shè)計(jì)構(gòu)建了Th1型細(xì)胞因子(IL-2和IFN-γ)融合蛋白基因表達(dá)質(zhì)粒(pFP),用以增強(qiáng)DNA疫苗免疫接種局部抗原遞呈細(xì)胞(APC)的抗原遞呈功能,有助于促進(jìn)Th1細(xì)胞分化并利于特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。本項(xiàng)研究以BALB/c小鼠、新西蘭家兔、非人類靈長類動(dòng)物猴及HBV轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠為動(dòng)物模型和研究對(duì)象,評(píng)價(jià)和探討pFP及EP分別增強(qiáng)和提高治療性HBV DNA疫苗免疫原性及質(zhì)粒宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染率的輔助效果和機(jī)理。 第一章雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗及在體電脈沖儀(EP)的研制和檢定 治療性雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗系采用基因重組技術(shù)構(gòu)建的HBV包膜中蛋白(preS2+S)基因真核表達(dá)質(zhì)粒(HBV DNA疫苗)聯(lián)合佐劑質(zhì)粒組成的雙質(zhì)粒治療性DNA疫苗。在接種HBV DNA疫苗的同時(shí),聯(lián)合注射編碼人白細(xì)胞介素融合蛋白(IL-2/IFN-γ)基因質(zhì)粒作為佐劑,以輔助前者對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答的誘導(dǎo),使其激活的T細(xì)胞向Th1亞群分化,以期望更有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答而打破因慢性HBV感染所導(dǎo)致的機(jī)體免疫耐受,達(dá)到清除病毒的治療目的。 本研究中,將編碼HBV胞膜中蛋白的基因序列插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1構(gòu)建了重組pS2.S質(zhì)粒。為增強(qiáng)其免疫原性,我們構(gòu)建了IL-2/IFN-γ融合蛋白佐劑質(zhì)粒pFP,它是由IL-2信號(hào)肽序列,IL-2全基因序列,24bp連接序列(編碼AGSGGGGS)以及IFN-γ的全基因序列順序連接在pCR的鈍端構(gòu)成。分子模擬根據(jù)pFP基因編碼的IL-2和IFN-γ融合蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行。pFP所表達(dá)的蛋白的空間構(gòu)象及與天然IL-2和IFN-γ構(gòu)象的比較通過數(shù)字分子模型軟件來(New Providence,PA)完成。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,以ELISA,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)-Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中目的基因表達(dá),并分別以CTLL-2依賴細(xì)胞株/MTT比色法和微量細(xì)胞病變抑制法(WISH-VSV)檢測(cè)pFP轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)上清中IL-2及IFN-γ活性。 雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后24 h能檢測(cè)到目的蛋白表達(dá),48 h時(shí)蛋白表達(dá)達(dá)最高值,其中HBsAg、IL-2和IFN-γ的濃度分別為17.6,9.2,8.6μg/L,72,96 h時(shí)蛋白表達(dá)呈明顯下降趨勢(shì)。而轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞上清均未檢測(cè)到HBsAg、IL-2和IFN-γ抗原活性。雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)產(chǎn)物的ECL Westernblotting鑒定結(jié)果,對(duì)照組未轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清和轉(zhuǎn)染空載體均未檢測(cè)出任何陽性反應(yīng)條帶,而pS2.S及pFP分別在分子質(zhì)量為30.6 kD及110kD處有特異性反應(yīng)條帶。 根據(jù)pFP基因編碼的IL-2/IFN-γ融合蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)模擬出其空間結(jié)構(gòu)。表達(dá)IL-2/IFN-γ融合蛋白的空間結(jié)構(gòu)能夠和天然的IL-2、IFN-γ空間結(jié)構(gòu)很好的對(duì)應(yīng)起來,這表明8個(gè)氨基酸的連接物能夠保證表達(dá)的IL-2和IFN-γ蛋白在空間折疊時(shí)互不影響,并能保證IL-2和IFN-γ的生物活性區(qū)域充分暴露在融合蛋白的表面。用IL-2和IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照,檢測(cè)pFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中的細(xì)胞因子活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,IL-2和IFN-γ具有生物學(xué)活性,轉(zhuǎn)染后48 h時(shí)上清中IL-2和IFN-γ的活性分別為260和80.5 U/mL,為檢測(cè)最高值,與相同樣本來源的ELISA檢測(cè)上清濃度的高峰值一致,這為質(zhì)粒pFP在治療性HBV DNA疫苗免疫過程中發(fā)揮佐劑作用的研究奠定了物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 在體電脈沖技術(shù)(EP)的電脈沖發(fā)生器和電極由上海交通大學(xué)藥學(xué)院提供,可發(fā)射0-300V電壓的方波信號(hào),一個(gè)脈沖持續(xù)10μs-100 ms。兩個(gè)針頭用的是針灸治療中所使用的針頭,長1.2mm,直徑0.3mm。兩個(gè)針頭距離1cm,分別代表陽極和陰極。以綠色熒光蛋白(GFP)及熒光素酶(LUC)編碼基因作為報(bào)告基因,觀察上述蛋白表達(dá)質(zhì)粒(pGFP,pLUC)經(jīng)EP導(dǎo)入小鼠脛前肌(TA)后目的蛋白的表達(dá)以及組織病理改變情況。結(jié)果顯示,EP處理中央部位肌肉組織損傷較為嚴(yán)重,可觀察到明顯肌細(xì)胞溶解、壞死及炎癥的發(fā)生,而邊緣區(qū)損傷較輕微。早期質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功并表達(dá)目的基因產(chǎn)物的肌細(xì)胞以邊緣區(qū)域?yàn)橹?可觀察到較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)。EP轉(zhuǎn)染5天熒光信號(hào)為高峰并隨時(shí)間的推移而逐步衰減,期間損傷嚴(yán)重的中央?yún)^(qū)域組織修復(fù)同時(shí)進(jìn)行,至21天肌肉組織基本恢復(fù)正常并可觀察到GFP陽性纖維的出現(xiàn),系細(xì)胞核置于中央的再生肌纖維。pLUC轉(zhuǎn)染小鼠TA實(shí)驗(yàn)結(jié)果,經(jīng)EP介導(dǎo)的的8只BALB/c小鼠局部TA組織熒光素酶活性為16136.3±9588.7RLU,而同期未經(jīng)EP介導(dǎo)的對(duì)照組酶活性僅為8.0±8.0RLU,組間相差4個(gè)數(shù)量級(jí),差異具非常顯著性(t=4.757,P=0.002)。 第二章pFP增強(qiáng)DNA疫苗免疫原性的實(shí)驗(yàn)研究 觀察佐劑質(zhì)粒(pFP)以不同劑量和給藥方式聯(lián)合DNA疫苗(pS_2·S)應(yīng)用誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫(血清抗-HBs水平)的效果,摸索出最適的免疫接種方法(包括免疫劑量、雙質(zhì)粒配伍和給藥途徑),以提高DNA疫苗的體內(nèi)免疫效果并為下一步確定細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物接種方式提供參考。 2.1 pFP聯(lián)合HBV DNA疫苗免疫誘導(dǎo)體液免疫結(jié)果 三個(gè)不同劑量的HBV DNA疫苗(pS2.S)單獨(dú)免疫BALB/c小鼠后血清抗—HBs水平及陽性數(shù)觀察結(jié)果,大(100μug/只)、中劑量組(50μg/只)初次免疫2周時(shí)分別為86.0±46.6mIU/ml,45.8±26.0mIU/ml并可誘導(dǎo)組內(nèi)全部動(dòng)物抗體水平呈陽性,而低劑量組(10μug/只)水平為16.2±9.3mIU/m,組內(nèi)抗體陽性數(shù)僅為3只(每組5只)。4、8、14周時(shí)各組抗體水平均有升高,但高、中劑量組升高較低劑量組更為明顯。 然而,低劑量(10μug/只)的pS2.S與相同劑量的pFP聯(lián)合免疫2、4周時(shí)血清抗體水平分別為115.9±19.4mIU/ml、130.1±29.5 mIU/ml,組內(nèi)全部5只小鼠2周時(shí)抗體水平呈陽性;pFP劑量升高未能增強(qiáng)pS2.S的免疫效果,其劑量為50ug/只,100 ug/只時(shí)聯(lián)合pS2.S接種免疫效果明顯降低,連同對(duì)照組[pS2.S+pcDNA3.1,10+10(ug/只)]較低劑量組[pS2.S+pFP,10+10(ug/只)]2周或4周時(shí)水平差異具顯著性(P＜0.05)。低劑量(1 ug/只,5 ug/只)的pFP雖未明顯減低血清抗體水平,但檢測(cè)值的均一性較差,且2,4周時(shí)未能誘導(dǎo)出組內(nèi)全部動(dòng)物抗體水平呈陽性。 為考察pFP(ug/只)接種時(shí)間和部位對(duì)聯(lián)合pS2.S(ug/只)免疫效果的影響,分別設(shè)置同時(shí)接種(Ⅰ組:pS2.S+pFP)、pFP于pS2.S免疫前3日接種(Ⅱ組:pFP+3d+pS2.S)、pFPpS2.S免疫后3日接種(Ⅲ組:pS2.S+3d+pFP)及pFP與pS2.S分左右腿脛前肌(TA)接種(Ⅳ組:pS2.S/TA+pFP/TA)四組,比較pS2.S免疫2周,4周時(shí)血清抗體水平及陽性數(shù)。結(jié)果顯示Ⅰ組免疫效果最佳,表現(xiàn)為抗體水平較高、檢測(cè)值個(gè)體差異較小,僅該組與Ⅳ組水平比較差異具顯著性(P＜0.05),且其組內(nèi)全部小鼠抗體水平均呈陽性。據(jù)此pFP聯(lián)合pS2.S免疫方式,觀察二者高[10+10(μg/只)]、中[10+10(μg/只)]、低劑量[10+10(μg/只)]聯(lián)合免疫效果顯示,高、中劑量組2、4周時(shí)均能誘導(dǎo)組內(nèi)全部動(dòng)物抗體水平呈陽性,二組4周時(shí)抗體水平較低劑量組升高明顯,差異具顯著性(P＜0.05)。 2.2 pFP聯(lián)合pS2.S誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答結(jié)果 pFP(50μg/只)聯(lián)合pS2·S(50μg/只)免疫組小鼠脾細(xì)胞體外經(jīng)HBsAg刺激培養(yǎng)上清IL-2/IFN-γ水平(263.5±52.0/38.4±11.9pg/ml)較同劑量的pS2·S;聯(lián)合空載體pcDNA3.1免疫組(149.6±22.2/10.1±4.3pg/ml)高,差異具顯著性(P＜0.01);IL-4水平于各組質(zhì)粒免疫影響不明顯。 pS2.S+pFP免疫組小鼠局部引流淋巴結(jié)(LN)中單核巨噬細(xì)胞(MPs)計(jì)數(shù)及其占LN細(xì)胞的百分比結(jié)果(18.0×10~5,8.2%)明顯高于pS_2·S+pcDNA3.1組(8.0×10~5,5.2%)及空載體免疫組(6.7×10~5,2.8%);同時(shí),pS2.S+pFP免疫組MPs能明顯刺激HBsAg致敏的T細(xì)胞增殖,其T細(xì)胞增值指數(shù)(SI:5.60)較pS2·S+pcDNA3.1組(2.55)及pcDNA3.1組(1.80)高。 HBV DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠特異性CTL活性結(jié)果,HBV DNA疫苗免疫誘導(dǎo)小鼠CTL活性的強(qiáng)弱與效/靶(E/T)比例及其上清液中IFN-γ分泌水平有一定關(guān)系。E/T為90:1及30:1時(shí),聯(lián)合佐劑質(zhì)粒免疫組(pS_2·S+pFP)CTL活性(細(xì)胞溶解率:52.5%,43.3%)較pS_2·S+pcDNA3.1組(45.4%,27.1%)高;E/T=10:1時(shí),pS_2·S+pFP組仍有CTL免疫活性(＞20%),而pS_2·S+pcDNA3.1組CTL活性＜20%,實(shí)驗(yàn)過程中空白載體pcDNA3.1對(duì)照組CTL活性于任一E/T比例條件下均＜20%。 抗原特異性分泌IFN-γ或IL-4T細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)結(jié)果,pS_2·S+pFP免疫健康BALB/c小鼠6周后,脾細(xì)胞在體外用HBsAg刺激后其誘生的IFN-γ細(xì)胞頻數(shù)(27.88±11.93 SFCs/3×10~5脾細(xì)胞),較同期對(duì)照組用空載體pcDNA3.1(1.43±1.51 SFCs/3×10~5脾細(xì)胞)高,差異據(jù)非常顯著性(t=6.211,P＜0.001)。脾細(xì)胞在體外用HBsAg刺激后其誘生的IL-4細(xì)胞頻數(shù)(5.00±2.00 SFCs/3×10~5脾細(xì)胞)較不用HBsAg組(2.00±1.10 SFCs/3×10~5脾細(xì)胞)高,但差異沒有顯著性(t=1.20,P＞0.05)。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)(FACS)實(shí)驗(yàn)分析,pS2.S+pFP免疫組誘導(dǎo)小鼠胞內(nèi)分泌IFN-γ的CD4~+ T細(xì)胞百分比(0.28±0.17%)與pcDNA3.1對(duì)照組(0.20±0.03%)比較,無顯著性差異(P＞0.05,t=0.130);而其誘導(dǎo)小鼠胞內(nèi)分泌IFN-γ的CD8~+ T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ百分比(0.69±0.08%)較對(duì)照組(0.24±0.12%)高,差異具顯著性(P＜0.001,t=4.167)。 2.3不同細(xì)胞因子表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合pS2.S免疫誘導(dǎo)HBsAg-特異性免疫應(yīng)答結(jié)果 為進(jìn)一步說明和證實(shí)IL-2/IFN-γ融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒(pFP)設(shè)計(jì)的合理性及作為佐劑增強(qiáng)pS2.S免疫原性的有效性,通過基因克隆及重組技術(shù)分別設(shè)計(jì)和構(gòu)建了鼠源性IL—2(pmIL-2),IFN-γ(pm IFN-γ)及IL-2/IFN-γ融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒(pmFP)作為佐劑,并以其小劑量(5μg/只)聯(lián)合pS2.S(5μg/只)接種BALB/c小鼠,并對(duì)各自誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答陽性數(shù)進(jìn)行觀察比較。結(jié)果顯示,pmIL-2+pmIFN-γ[(2.5+2.5)μg/只]聯(lián)合pS2.S免疫誘導(dǎo)HBsAg-特異性體液免疫和細(xì)胞免疫效果最佳,并與相同劑量的pS_2·S+pFP組效果相當(dāng),主要表現(xiàn)為其組內(nèi)誘導(dǎo)的特異性分泌IFN-γT細(xì)胞陽性反應(yīng)動(dòng)物數(shù)目與單獨(dú)使用細(xì)胞因子質(zhì)粒(pmIL-2或pm IFN-γ)及pmFP免疫組(未獲得陽性應(yīng)答)具本質(zhì)性差別,提示IL-2及IFN-γ質(zhì)粒作為免疫佐劑在增強(qiáng)HBV DNA疫苗免疫效果上具有協(xié)同效應(yīng)。而鼠源性融合蛋白(pmFP)在本實(shí)驗(yàn)中未顯示出佐劑效應(yīng),推測(cè)可能與其構(gòu)建時(shí)所選用的連接肽基因(與人源性pFP相同)未能在融合蛋白分子結(jié)構(gòu)上保持IL-2及IFN-γ各自活性有關(guān)。 第三章在體電脈沖法提高HBV DNA疫苗免疫效果的實(shí)驗(yàn)研究 本研究以新西蘭家兔、恒河猴及食蟹猴為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,觀察評(píng)價(jià)EP通過提高裸DNA質(zhì)粒在宿主體內(nèi)細(xì)胞導(dǎo)入率,增強(qiáng)HBV DNA疫苗誘導(dǎo)大體重動(dòng)物特異性免疫應(yīng)答效果。另采用高水力學(xué)注射法(hydrodynamic injection或水力注射法)將質(zhì)粒pS2.S轉(zhuǎn)染至BALB/c小鼠肝細(xì)胞內(nèi)作為模型,觀察EP介導(dǎo)的pS2.S免疫對(duì)該模型小鼠肝細(xì)胞HBsAg表達(dá)的抑制效果。 3.1 EP聯(lián)合接種HBV DNA疫苗誘導(dǎo)兔和猴特異性免疫應(yīng)答結(jié)果 整個(gè)實(shí)驗(yàn)整個(gè)觀察過程,未經(jīng)EP介導(dǎo)的高劑量[(1000+1000)μg/只]雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗(pS2.S+pFP)免疫組內(nèi)各只動(dòng)物(家兔或猴)血清抗-HBs均為陰性水平(＜10mIU/ml)。 (1)經(jīng)EP介導(dǎo)的雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗免疫于新西蘭家兔實(shí)驗(yàn)結(jié)果:2周時(shí)大劑量(50+50μg/只)及中劑量組(25+25μg/只)分別有3/5只,1/5只動(dòng)物血清抗-HBs水平呈陽性(＞10 mIu/ml)至4周時(shí)陽性數(shù)雖無變化,但二組水平均明顯升高。第1次免疫后13周(即第10周增強(qiáng)免疫后3周)時(shí),EP介導(dǎo)的大、中、小劑量組動(dòng)物均有血清抗-HBs陽性出現(xiàn),分別為5、4與4只,其中大劑量組陽性數(shù)與同期對(duì)照組比較,差異具有顯著性(P=0.008)。 (2)EP介導(dǎo)的雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗免疫恒河猴實(shí)驗(yàn)結(jié)果:初次免疫后8周(即第1次增強(qiáng)免疫后4周)時(shí),大、中劑量組,分別有3及2只動(dòng)物血清抗-HBs陽性,至免疫后13周(即第2次增強(qiáng)免疫后3周)時(shí),大、中、小3個(gè)劑量組全部3只動(dòng)物血清抗-HBs為陽性。 (3)EP介導(dǎo)的雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗免疫食蟹猴免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果:中劑量組(660μg/kg)接種后第6周即有1動(dòng)物血清中測(cè)出較高滴度的抗-HBs;隨著接種次數(shù)增加,血清抗-HBs陽性的動(dòng)物數(shù)量也隨之增加,至16周時(shí)低(200μg/kg)、中劑量組內(nèi)全部動(dòng)物血清抗體呈陽性,而高劑量組(2000μg/kg)陽性數(shù)為2/6只;各組血清-HBs水平高峰期大約在23～25周之間,隨后小幅下降。16周時(shí)EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗免疫高、中、低劑量組各3只食蟹猴中分別有3、2、3只HBsAg特異性IFN-γT細(xì)胞計(jì)數(shù)陽性;29周時(shí)高、中、低劑量組全部動(dòng)物應(yīng)答呈陽性,其計(jì)數(shù)結(jié)果分別為30.0±13.5 SFCs/3×10~5 PBMCs,30.7±26.3 SFCs/3×10~5 PBMCs及17.7±6.4 SFCs/3×10~5 PBMCs;而相同時(shí)間佐劑組和PBS對(duì)照組3只食蟹猴均為陰性。 3.2 EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗免疫對(duì)小鼠肝內(nèi)HBsAg表達(dá)水平的影響 小鼠經(jīng)水力學(xué)法注射pS2.S后12小時(shí)(hr.)即可檢測(cè)出HBsAg表達(dá)(78.5±11.7ng/ml),24hr.肝內(nèi)HBsAg表達(dá)為高峰期(108.5±21.5 ng/ml),以后表達(dá)量隨時(shí)間而降低。EP(pS2.S+EP)與未經(jīng)EP介導(dǎo)(pS2.S/IM)的HBV DNA疫苗免疫后的小鼠肝組織HBsAg水平均有不同程度的降低,pS2.S/IM組12hr.(44.8±16.6 ng/m),72hr.(15.1±3.7 ng/ml)HBsAg水平較同一時(shí)間未免疫對(duì)照組(78.5±11.7ng/ml,22.8±4.5 ng/ml)低,差異具非常顯著(P＜0.01)及顯著性(P＜0.05);pS2.S+EP組于12hr.(8.3±0.6 ng/ml),24hr.(9.9±4.1ng/ml)及72hr.水平(3.3±0.3ng/ml)較同期對(duì)照組(78.5±11.7ng/ml,108.5±21.5 ng/ml,22.8±4.5 ng/ml)低,差異具非常顯著性(P＜0.01),較同期pS2.S/IM組(44.8±16.6 ng/m,96.3±34.3 ng/ml,15.1±3.7 ng/ml)水平低,差異亦具非常顯著性(P＜0.01)。 免疫組化計(jì)數(shù)HBsAg染色陽性細(xì)胞結(jié)果,pS2.S+EP組于觀察期間各個(gè)時(shí)間點(diǎn)陽性染色肝細(xì)胞數(shù)目均較對(duì)照組少,差異分別具顯著(2、5、7天,P＜0.05)及非常顯著性(12hr.、1天、3天,P＜0.01)。 觀察肝組織病理及血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平變化結(jié)果發(fā)現(xiàn),動(dòng)物經(jīng)水力注射轉(zhuǎn)染pS2.S后肝組織病理無明顯改變,盡管血清ALT呈現(xiàn)短暫性升高,但各時(shí)間點(diǎn)上pS2.S+EP與對(duì)照組比較無顯著性差異。 第四章pFP聯(lián)合EP提高治療性HBV DNA疫苗效果的評(píng)價(jià) 本研究以健康BALB/c小鼠及HBV轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠為研究對(duì)象,分別比較分析和系統(tǒng)研究pFP、EP單獨(dú)和二者聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)HBV DNA疫苗體液免疫及細(xì)胞免疫效果的輔助作用,探尋最佳的接種組合方式及給藥劑量。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步評(píng)價(jià)和探討聯(lián)合免疫增強(qiáng)HBV Tg小鼠細(xì)胞免疫及促進(jìn)病毒應(yīng)答的治療效果及初步作用機(jī)理。 4.1健康BALB/c小鼠免疫應(yīng)答效果 (1)血清抗-HBs抗體水平檢測(cè):EP介導(dǎo)的DNA疫苗免疫組間比較,A組(pS2.S+pFP+EP)血清抗-HBs水平為51.2±50.0 mIU/ml,血清陽性率為89%,B組(pS2.S+pcDNA3.1+EP)血清抗HBs抗體水平為14.8±7.6 mIU/ml,血清陽性率為64%。A組血清抗-HBs水平及血清陽性率均高于B組(P=0.033,P=0.026)。pFP及非pFP(pcDNA3.1)聯(lián)合DNA疫苗免疫組間血清抗體陽性率比較,即A組與C組(pS2.S+pFP+pEP)及B組與D組(pS2.S+pcDNA3.1+pEP)比較,差異均具顯著性(P=0.000);同時(shí),EP與pFP各自增強(qiáng)血清抗體應(yīng)答陽性率比較(B組vs.C組)差異亦具顯著性(P=0.001)。 (2) HBsAg特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答水平檢測(cè):在EP或非EP(pEP)介導(dǎo)pS2.S免疫反應(yīng)比較中,B組(pS2.S+pcDNA3.1+EP)和D組(pS2.S+pcDNA3.1+pEP)以pcDNA3.1質(zhì)粒代替了A組(pS2.S+pFP+EP)、C組(pS2.S+pFP+pEP)的pFP,結(jié)果B、D組的HBsAg特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答水平及陽性率(B組:84±70 SFCs/3×10~5脾細(xì)胞,28%;D組:17±29 SFCs/3×10~5脾細(xì)胞,11%)較相對(duì)應(yīng)的A、C組(A組:207±103 SFCs/3×10~5脾細(xì)胞,78%;C組:156±126 SFCs/3×10~5脾細(xì)胞,50%)低,其中A、B二組陽性率差異經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析具有顯著性(P=0.007)。而細(xì)胞計(jì)數(shù)(SFCs/3×10~5脾細(xì)胞)結(jié)果經(jīng)異方差多組內(nèi)兩組間多重統(tǒng)計(jì)分析比較,僅A組與D組比較差異具有顯著性(P=0.025)。 研究結(jié)果表明,EP以提高HBV DNA疫苗體液免疫應(yīng)答效果最為明顯,其輔助作用較pFP強(qiáng);而在本研究中僅pFP能顯示出明顯增強(qiáng)DNA疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫效果的佐劑作用。因此,我們認(rèn)為EP聯(lián)合pFP在HBV DNA疫苗免疫(即A組:pS2.S+pFP+EP)能獲得最佳的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答效果。以上述組合方式接種不同劑量的HBV DNA疫苗,結(jié)果顯示具有一定的劑量依賴性,為進(jìn)一步的HBV Tg動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)有效劑量的選擇奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 4.2 HBV Tg小鼠模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (1) HBV DNA血清定量檢測(cè)結(jié)果,pS2.S+pFP組免疫第8周(13317±2539拷貝/ml)、12周時(shí)(6462±3359拷貝/ml)分別較免疫前(36159±7769拷貝/ml)明顯減低,差異具非常顯著性(P＜0.01);pS2.S+pcDNA3.1組4周(20618±9523拷貝/ml)及8周時(shí)(23818±5319拷貝/ml)均較其免疫前水平(36090±4421拷貝/ml)明顯降低(P＜0.01),但不能持續(xù)到12周時(shí)(27691±13071拷貝/ml),并明顯高于此時(shí)pS2.S+pFP組水平,差異具非常顯著性(P＜0.01)。 (2)病毒應(yīng)答與細(xì)胞免疫應(yīng)答的平行比較:各組Tg小鼠血清HBsAg水平無明顯變化,但肝臟免疫組化結(jié)果顯示,HBsAg表達(dá)水平存在差別。pS2.S+pFP和pS2.S+pcDNA3.1組分別有4只和2只HBV Tg小鼠肝組織切片HBsAg表達(dá)陽性的肝細(xì)胞低于觀察視野總計(jì)數(shù)細(xì)胞的25%,pcDNA3.1對(duì)照組Tg鼠HBsAg表達(dá)陽性的肝細(xì)胞均在25%以上。pS2.S+pFP組3只(3/5)ALT升高(≥2×ULN),pS2.S+pcDNA3.1組和pcDNA3.1組均只有1只檢測(cè)到ALT活性升高。pS2.S+pFP組HBsAg特異性IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)(46.02±6.3SFCs/3×10~5個(gè)脾細(xì)胞)亦多于pS2.S+pcDNA3.1(19.4±10.3SFCs/3×10~5個(gè)脾細(xì)胞)或pcDNA3.1組(14.0±8.9SFCs/3×10~5個(gè)脾細(xì)胞),其中pS2.S+pFP組較pcDNA3.1組差異具顯著性(P＜0.05,t=2.571),且三組動(dòng)物個(gè)體觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBsAg特異性SFCs的升高與血清ALT基本一致,并伴隨著血清HBV DNA及肝組細(xì)胞HBsAg表達(dá)水平的降低。 本研究結(jié)果表明,pFP能夠顯著增強(qiáng)EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗免疫H BVTg的治療效果,表現(xiàn)為pFP聯(lián)合免疫能持續(xù)性抑制HBV DNA的復(fù)制及表達(dá)。EP的引用大大降低了質(zhì)粒的有效接種劑量。觀察終點(diǎn)(12周)時(shí),pFP聯(lián)合HBV DNA疫苗免疫組Tg小鼠血清HBV DNA水平顯著低于DNA疫苗單獨(dú)免疫及對(duì)照組,個(gè)體血清HBV DNA及肝組織HBsAg表達(dá)水平降低的同時(shí),伴隨其血清ALT水平及HBsAg特異性IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)目的升高。值得注意的是,DNA疫苗免疫組肝臟細(xì)胞空泡樣變較對(duì)照組明顯,可能與DNA疫苗免疫所介導(dǎo)的HBV特異性或非特異性免疫應(yīng)答造成的肝臟炎癥損傷有關(guān)。由于小鼠動(dòng)物模型基礎(chǔ)上研究外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)免疫應(yīng)答水平的局限,本文結(jié)果中病原學(xué)與免疫學(xué)應(yīng)答相關(guān)性的研究?jī)H限于觀察結(jié)束的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,但所要提示的與近年來文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論基本一致,即HBV的清除與溶細(xì)胞或非溶細(xì)胞性免疫應(yīng)答有關(guān)。 綜上所述,Th1型細(xì)胞因子IL-2/IFN-γ融合蛋白編碼基因質(zhì)粒(pFP)聯(lián)合HBV DNA疫苗(pS2.S)接種能有效增強(qiáng)pS2.S的免疫效果,pFP與pS_2S劑量按1:1配伍混合共注射免疫效果最佳;在體電脈沖(EP)技術(shù)通過提高質(zhì)粒DNA體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率,有效增強(qiáng)HBV DNA疫苗在各種動(dòng)物(包括非人類靈長動(dòng)物)誘導(dǎo)的免疫效果;pFP通過加強(qiáng)初始T細(xì)胞向Th1方向分化,能夠增強(qiáng)HBVDNA疫苗免疫的治療性作用,與EP聯(lián)合HBV DNA疫苗治療HBV Tg小鼠后,能在一定程度上抑制Tg小鼠HBV DNA復(fù)制和HBsAg表達(dá)。 以上研究結(jié)果有益于目前DNA疫苗及裸質(zhì)�；蛑委熂夹g(shù)瓶頸性難題的解決,并為尋找更有效的抗HBV感染免疫治療策略提供新的技術(shù)途徑和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2169811