發(fā)布時(shí)間：2018-08-05 20:36

【摘要】： 目的:探索人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow stromal cells,hMSCs)體外分離、培養(yǎng)及純化的合適實(shí)驗(yàn)條件,并探討神經(jīng)生長(zhǎng)因子體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)分化成神經(jīng)細(xì)胞的可行性。 方法:①?gòu)恼３扇索墓侵蝎@取hMSCs,采用密度梯度離心法和全骨髓貼壁法相結(jié)合的方法分離人骨髓低密度單個(gè)核細(xì)胞,常規(guī)傳代、培養(yǎng)獲得純化的hMSCs。②取第2、4、6代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的hMSCs,以含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)消化后,采用MTT法,描繪細(xì)胞增殖曲線。③取第3～5代hMSCs,接近70%～80%融合后,分為實(shí)驗(yàn)組:用堿性成纖維生長(zhǎng)因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)對(duì)hMSCs進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)24h,再分別用濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml神經(jīng)生長(zhǎng)因子培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化;對(duì)照組:僅加等量無(wú)血清培養(yǎng)基。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察誘導(dǎo)后各組細(xì)胞形態(tài)變化。④細(xì)胞培養(yǎng)后,第0.5d、1d、3d、5d,采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)的表達(dá),選細(xì)胞密度適中視野計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),對(duì)比各組細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)比例。 結(jié)果:①骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線:培養(yǎng)第1～2d為潛伏期,細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢;此后,細(xì)胞增殖加快并迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,至第6～7d達(dá)到高峰,以后細(xì)胞增殖減慢,進(jìn)入平臺(tái)期。 ②hMSCs誘導(dǎo)分化后的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果:12h后部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,表現(xiàn)為胞體變大,有類似軸突和樹突的細(xì)長(zhǎng)突起,24h后表現(xiàn)更為明顯,部分細(xì)胞間也可見網(wǎng)絡(luò)狀排列,細(xì)胞死亡現(xiàn)象不明顯;對(duì)照組無(wú)明顯的形態(tài)學(xué)改變,仍為長(zhǎng)梭形細(xì)胞。 ③神經(jīng)元樣細(xì)胞免疫組化測(cè)定結(jié)果:不同濃度神經(jīng)生長(zhǎng)因子組NSE、Nestin表達(dá)均為陽(yáng)性,表現(xiàn)為胞體和突起被染成棕黃色;對(duì)照組無(wú)陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。 ④不同濃度神經(jīng)生長(zhǎng)因子作用下的神經(jīng)元樣細(xì)胞分化率有差別。濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、及200ng/ml分化率分別為(35.6±4.4)%、(61.9±3.4)%、(57.3±5.7)%和(57.2±4.8)%,不同濃度的神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有顯著差異(F=338.71,P0.05),其中100ng/ml組的分化率最高,各實(shí)驗(yàn)組比較:濃度為100ng/ml、濃度為150ng/ml及濃度為200ng/ml組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均高于濃度為50ng/ml組(P0.01),但后三者比較,差異無(wú)顯著性(P0.05)。⑤100ng/ml NGF在0.5d、1d、3d、5d的分化率分別為(27.8±5.6)%、(60.5±6.7)%、(61.9±3.4)%和(30.7±3.5)%,不同時(shí)間相同濃度下神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有顯著差異(F=136.03,P0.01),其中第3d的分化率最高,但與第1d陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較,差異無(wú)顯著性(P0.05),第5d的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少,與第1,3d比較差異有顯著性(P0.01)。 結(jié)論:①本實(shí)驗(yàn)建立的密度梯度離心法和全骨髓貼壁法相結(jié)合,體外分離、純化hMSCs的方法,可能是目前操作簡(jiǎn)單、不易污染及分離純度高的一種較好的方法。 ②NGF可誘導(dǎo)hMSCs定向分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞且存活時(shí)間長(zhǎng),100ng/ml濃度的NGF可以起到較好的促進(jìn)hMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的作用。
[Abstract]:Objective: to explore the suitable experimental conditions for the isolation, culture and purification of human bone marrow mesenchymal stem cells (human bone marrow stromal cells) in vitro, and to explore the feasibility of nerve growth factor (NGF) inducing the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSCs) into nerve cells in vitro. Methods Human bone marrow low density mononuclear cells were isolated from normal adult iliac bone by using density gradient centrifugation and whole bone marrow adherent method. The purified hMSCs.2 was cultured and digested in the DMEM medium containing fetal bovine serum for the second and fourth generation of HMSCs. After digesting and digesting, MTT method was used to depict the cell proliferation curve. 3. The 3rd generation hMSCs were obtained, which were close to 70%, 80% of the cells fused. The experimental group was divided into two groups: the hMSCs was preinduced by basic fibroblast growth factor (Basic fibroblast growth) for 24 h, and then induced by 50ng / ml 100ng / ml NGF medium, while the control group was treated with the same amount of serum-free medium. The morphological changes of cells in each group were observed by morphological observation. 4 cells were cultured on the 1st and 3rd day after induction, and the expression of NSCs labeled neuron specific enolase (NSE),) nestin (Nestin) was detected by immunohistochemical method. The number of positive cells was calculated with moderate cell density visual field, and the proportion of positive cells in each group was compared. Results the growth curve of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs): the first day of culture was the incubation period, the cell growth was slow, then the cell proliferation accelerated and rapidly entered the logarithmic growth phase, and reached the peak at the 6th day, then the cell proliferation slowed down. After 2hMSCs induced differentiation, morphological changes occurred in some cells at 12 h, showing that the cell bodies became larger, and the slender processes with axons and dendrites became more obvious 24 hours later. Some cells could also be seen network arrangement, the phenomenon of cell death was not obvious, the control group had no obvious morphological changes, The expression of NSE-nestin was positive in different concentrations of NGF, and the cell bodies and processes were stained brown. No positive results were found in the control group. 4 the differentiation rate of neuron-like cells in different concentrations of nerve growth factor was different. The differentiation rate of 200ng/ml was (35.6 鹵4.4), (61.9 鹵3.4), (57.3 鹵5.7)% and (57.2 鹵4.8), respectively. There were significant differences in the number of NGF-induced positive cells in different concentrations (F338.71P0.05). The number of positive cells in 100 ng / ml, 150ng/ml and 200ng/ml groups was higher than that in 50ng/ml group (P0.01). There was no significant difference (P0.05). 5100ng / ml NGF differentiation rate was (27.8 鹵5.6), (60.5 鹵6.7)%, (61.9 鹵3.4)% and (30.7 鹵3.5) in 0.5 day, (60.5 鹵6.7), (61.9 鹵3.4)% and (30.7 鹵3.5), respectively. There was significant difference in the number of positive cells induced by nerve growth factor at the same concentration at different time (FF136.03 / P0.01), and the differentiation rate was the highest on the 3rd day, but compared with the number of positive cells on the first day. There was no significant difference (P0.05), but the number of positive cells decreased on the 5th day, which was significantly different from that on the 1st day (P0.01). Conclusion the density gradient centrifugation combined with the whole bone marrow adherent method is a simple method for the isolation and purification of hMSCs in vitro. 2NGF can induce hMSCs to differentiate into neuron-like cells with long survival time of 100ng / ml NGF can promote hMSCs to neuron-like cells. The role of cell differentiation.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2166949