【摘要】： 結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁是維持其生長(zhǎng)和增殖的重要結(jié)構(gòu),主要由分枝菌酸、阿拉伯聚糖半乳聚糖和肽聚糖(mycolic acid-arabinogalactan- petidoglycan,mAGP)三部分組成,其中肽聚糖是細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的。青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding proteins, PBPs)參與肽聚糖的合成和維護(hù),因此,鑒定結(jié)核分枝桿菌中的青霉素結(jié)合蛋白,有助于了解肽聚糖的代謝機(jī)理。 我們通過(guò)生物信息學(xué)的方法和細(xì)菌之間的相似性預(yù)測(cè)結(jié)核分枝桿菌基因組中的Rv3627c基因的表達(dá)產(chǎn)物為可能的PBPs,其結(jié)構(gòu)兩次跨膜,并且可能具有羧肽酶或內(nèi)肽酶的活性,參與肽聚糖的重建和多肽鏈之間的交聯(lián),有可能成為新的潛在的抗結(jié)核藥物作用靶點(diǎn)。為了分析結(jié)核分枝桿菌中基因Rv3627c的功能,我們?cè)O(shè)計(jì)此課題進(jìn)行研究:首先克隆結(jié)核分枝桿菌的Rv3627c基因,然后分別在大腸桿菌BL21(DE3)、C41(DE3)和恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis,Sm)中表達(dá)重組蛋白,并設(shè)計(jì)酶促反應(yīng)分析該蛋白質(zhì)的功能。 目的:(1)通過(guò)PCR的方法從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的基因組DNA中擴(kuò)增出Rv3627c基因; (2)分別構(gòu)建pET29b-Rv3627c和pVV16-Rv3627c表達(dá)載體;(3)分別在大腸桿菌BL21(DE3)、C41(DE3)和恥垢分枝桿菌mc2155中表達(dá)Rv3627c蛋白;(4)分析Rv3627c蛋白是否具有羧肽酶活性。 結(jié)果: 1. Rv3627c基因的克隆 從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genolist.pasteur. fr/TubercuList/)中獲得Rv3627c基因的核苷酸序列(1395 bp)。根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計(jì)上下游PCR引物,并分別在其上游引物和下游引物的5’端引入了NdeI和XhoI限制性酶切位點(diǎn)。以H37Rv菌株基因組DNA為模板擴(kuò)增出了Rv3627c基因。 將Rv3627c基因克隆到pMD18載體,并對(duì)Rv3627c進(jìn)行DNA序列測(cè)定。結(jié)果顯示所克隆的Rv3627c基因與H37Rv菌株基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中Rv3627c基因的核苷酸序列完全一致,說(shuō)明在本次實(shí)驗(yàn)中通過(guò)PCR的方法獲得的Rv3627c基因?yàn)檎_擴(kuò)增的基因,無(wú)堿基突變。 2. pET29b-Rv3627c的構(gòu)建及Rv3627c蛋白在大腸桿菌中的表達(dá) 用NdeI和XhoI雙酶切pMD-Rv3627c,將Rv3627c基因克隆到表達(dá)載體pET29b。在pET29b-Rv3627c中,Rv3627c蛋白的C端與質(zhì)粒上的組氨酸標(biāo)簽形成融合蛋白。 用pET29b-Rv3627c質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3) ,并加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。用SDS-PAGE鑒定了誘導(dǎo)表達(dá)的Rv3627c蛋白。 用pET29b-Rv3627c質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌C41(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞,用0.1 mM IPTG在37℃誘導(dǎo)C41(DE3)/pET29b-Rv3627c細(xì)菌3小時(shí)。超聲破碎細(xì)菌后對(duì)上清和沉淀組分進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果表明Rv3627c蛋白在大腸桿菌C41(DE3)中被誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)組氨酸-Ni2+親和層析技術(shù)純化Rv3627c蛋白,對(duì)純化的Rv3627c蛋白進(jìn)行定量(考馬斯亮藍(lán)法),第1洗脫組分中Rv3627c蛋白濃度為1.03 mg/ml,并通過(guò)SDS-PAGE鑒定純化的Rv3627c蛋白。 3. pVV16-Rv3627c表達(dá)載體的構(gòu)建及Rv3627c蛋白在恥垢分枝桿菌mc2155中的表達(dá) 用NdeI和HindIII雙酶切pMD-Rv3627c,將Rv3627c基因克隆到表達(dá)載體pVV16。用pVV16-Rv3627c表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化mc2155感受態(tài)細(xì)胞。挑選6個(gè)單菌落接種到5 ml含Ka(n25mg/ml)和Tween8(0終濃度0.05%)的LB液體培養(yǎng)基中,在37°C振蕩培養(yǎng)72小時(shí),然后大體積培養(yǎng)mc2155p/VV16-Rv3627c細(xì)菌。收集、超聲破碎細(xì)菌,對(duì)上清和沉淀組分進(jìn)行了SDS-PAGE分析,但無(wú)預(yù)期的蛋白條帶。 4. Rv3627c蛋白的酶活性分析 提取mc2155p/VV16-Rv3627c及野生型mc2155細(xì)胞壁中的胞壁肽作為底物,設(shè)計(jì)了酶促反應(yīng)。利用紙層析方法檢測(cè)反應(yīng)生成的產(chǎn)物。通過(guò)結(jié)果推斷結(jié)核分枝桿菌Rv3627c基因表達(dá)的蛋白質(zhì)可能具有羧肽酶活性。 結(jié)論:在本次研究中,我們分別構(gòu)建了pET29b-Rv3627c和pVV16-Rv3627c表達(dá)載體,并分別在大腸桿菌BL21(DE3)和C41(DE3)表達(dá)了Rv3627c蛋白,然后對(duì)Rv3627c蛋白進(jìn)行了鑒定和功能分析,推測(cè)其可能具有羧肽酶活性。這一研究結(jié)果為我們深入研究結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的代謝機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:The cell wall of Mycobacterium tuberculosis is an important structure to maintain its growth and proliferation, mainly composed of three parts, Mycobacterium acid, Arabia galactan and peptidoglycan (mycolic acid-arabinogalactan- petidoglycan, mAGP). Peptidoglycan is essential for the growth of bacteria. Penicillin binding protein (penicillin binding proteins, PBPs). Therefore, identification of penicillin binding proteins in Mycobacterium tuberculosis is helpful to understand the mechanism of peptidoglycan metabolism.
We predict that the Rv3627c gene expression product in the Mycobacterium tuberculosis genome is a possible PBPs by bioinformatics and the similarity between bacteria. It has two transmembrane structures and may have the activity of carboxypeptidase or endopeptidase. It may be a potential new potential to participate in the reconstruction of peptidoglycan and the cross-linking between polypeptide chains. In order to analyze the function of the gene Rv3627c in Mycobacterium tuberculosis, we designed this topic to study: first, we clone the Rv3627c gene of Mycobacterium tuberculosis and then express the recombinant protein in Escherichia coli BL21 (DE3), C41 (DE3) and Mycobacterium fouling (Mycobacterium smegmatis, Sm) and design the enzyme. The function of the protein was analyzed by reaction.
Objective: (1) the Rv3627c gene was amplified from genomic DNA of Mycobacterium tuberculosis H37Rv by PCR method; (2) construct pET29b-Rv3627c and pVV16-Rv3627c expression vectors respectively; (3) express Rv3627c protein in Escherichia coli BL21 (DE3), C41 (DE3) and Mycobacterium fouling bacilli, and (4) to analyze whether the protein has carboxypeptidase activity. Sex.
Result:
Cloning of 1. Rv3627c gene
The nucleotide sequence of the Rv3627c gene (1395 BP) was obtained from the genomic database of Mycobacterium tuberculosis H37Rv (http://genolist.pasteur. fr/TubercuList/). The upstream and downstream PCR primers were designed according to its nucleotide sequence, and the restriction sites of NdeI and XhoI were introduced into the upstream and 5 'ends of the downstream primers respectively. The genomic DNA amplified the Rv3627c gene from the template.
The Rv3627c gene was cloned to the pMD18 vector and the DNA sequence of Rv3627c was measured. The results showed that the cloned Rv3627c gene was identical to the nucleotide sequence of the Rv3627c gene in the genome database of the H37Rv strain, indicating that the Rv3627c base obtained by PCR's method in this experiment has no base mutation because of the correct amplification of the gene.
Construction of 2. pET29b-Rv3627c and expression of Rv3627c protein in E. coli
The Rv3627c gene was cloned into the expression vector pET29b. in pET29b-Rv3627c with the NdeI and XhoI double enzymes, and the C end of the Rv3627c protein and the histidine tag on the plasmid formed the fusion protein.
The pET29b-Rv3627c plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3), and IPTG was used to induce the expression of recombinant protein. The induced expression of Rv3627c protein was identified by SDS-PAGE.
PET29b-Rv3627c plasmids were used to transform the receptive cells of Escherichia coli C41 (DE3), and C41 (DE3) /pET29b-Rv3627c bacteria were induced by 0.1 mM IPTG at 37. After ultrasonic breakage bacteria, the SDS-PAGE analysis of the supernatant and precipitation components was carried out. The results showed that the Rv3627c protein was induced in the C41 (DE3) of Escherichia coli. The purified Rv3627c protein was purified by technique, and the purified Rv3627c protein was quantified (Kaumas brilliant blue). The concentration of Rv3627c protein in the first elution components was 1.03 mg/ml, and the purified Rv3627c protein was identified by SDS-PAGE.
Construction of 3. pVV16-Rv3627c expression vector and expression of Rv3627c protein in Mycobacterium Mycobacterium mc2155
The Rv3627c gene was cloned to the expression vector pVV16. by NdeI and HindIII, and mc2155 receptive cells were transformed by pVV16-Rv3627c expression vector, and 6 single colonies were selected to be inoculated into the 5 ml LB liquid medium containing Ka (n25mg/ml) and Tween8 (0 terminal concentration 0.05%), and cultured for 72 hours at 37 degrees, and then cultured in large volume. -Rv3627c bacteria. Collection, ultrasonic breaking bacteria, SDS-PAGE analysis of supernatant and precipitation components, but no expected protein bands.
Analysis of enzyme activity of 4. Rv3627c protein
The enzymatic reaction was designed by extracting the cell wall peptide of mc2155p/VV16-Rv3627c and wild type mc2155 cell wall. The results of the reaction were detected by paper chromatography. It was concluded that the protein expressed by Rv3627c gene of Mycobacterium tuberculosis may have carboxypeptidase activity.
Conclusion: in this study, we constructed pET29b-Rv3627c and pVV16-Rv3627c expression vectors respectively, and expressed Rv3627c protein in Escherichia coli BL21 (DE3) and C41 (DE3) respectively. Then, we identified and functional analysis of Rv3627c protein to speculate that it might have carboxypeptidase activity. This study results in our in-depth study of tuberculosis branching. The metabolic mechanism of the cell wall of bacilli laid the foundation.
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R378;Q78

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本文編號(hào)：2152969