【摘要】： 實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑隗w外探討不同濃度IFN-α對(duì)人臍血來(lái)源DC分化成熟及功能的影響,對(duì)DC表面標(biāo)志和功能進(jìn)行檢測(cè)；同時(shí)進(jìn)行肝癌細(xì)胞凍融抗原負(fù)載DC介導(dǎo)CTL對(duì)肝癌細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)；評(píng)價(jià)該實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)DC的可行性及應(yīng)用肝癌細(xì)胞凍融抗原負(fù)載DC介導(dǎo)的抗肝癌效應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)方法從臍血中分離單個(gè)核細(xì)胞(CBMNC),在完全培養(yǎng)液(RPMI-1640+5%胎牛血清)中添加GM-CSF(1000U/ml)、IL-4(500U/ml)及不同濃度INF-a(A至E五組濃度為0、100、500、700、1000U/ml)聯(lián)合誘導(dǎo)CBMNC分化為DC,第7天收獲DC。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞儀測(cè)定DC表面標(biāo)志CD14、CD83、CD86、CD40、CDla和HLA-DR的表達(dá),MTT法測(cè)定DC對(duì)同種異體淋巴細(xì)胞的增殖能力和DC介導(dǎo)CTL對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷率,ELISA測(cè)定DC上清液中IL-12、IFN-y和IL-10細(xì)胞因子的含量。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.CBMNC在細(xì)胞因子GM-CSF+IL-4及不同濃度INF-a的共同作用下,培養(yǎng)3天大部分細(xì)胞仍貼壁生長(zhǎng),并可見(jiàn)部分細(xì)胞形成小的集落,未見(jiàn)明顯樹(shù)突狀樣突起；第7天可見(jiàn)細(xì)胞表面有明顯偽足樣突起,呈現(xiàn)典型的樹(shù)突狀形態(tài)。2.流式細(xì)胞儀分析表明第7天收獲的細(xì)胞高表達(dá)成熟DC的表面標(biāo)志,其中本實(shí)驗(yàn)第1部分的INF-a濃度為500 U/ml時(shí)的表達(dá)率(%)分別為CD86(95.10±1.53)、CD83(75.11±1.63)、CD1a(38.75±1.93)、HLA-DR(88.75±1.65)。3.在一定濃度范圍內(nèi)(0、100、500、700U/ml), INF-a誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC刺激異體淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)呈遞增趨勢(shì)(P0.05),其中以INF-a濃度為700U/ml且T：DC=10：1時(shí)刺激異體淋巴細(xì)胞增殖的OD值最高(0.485±0.100),與其余組存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4.本實(shí)驗(yàn)中,INF-a濃度為700U/ml時(shí),負(fù)載SMMC-7721抗原的DC誘導(dǎo)異體CTL對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷率(%)最高(30.1±1.6)；與其余組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。5. ELISA方法檢測(cè)A、B、C、D、E組第3天DC上清液細(xì)胞因子含量各組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；第7天時(shí)各組的細(xì)胞因子含量均有升高,其中D組的IL-12(37.69±2.67 pg/ml)、IFN-y(49.94±1.35 pg/ml)含量最高,與其余各組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；而D組的IL-10(32.34±2.49 pg/ml)含量最低,與其余各組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論臍血分離的CBMNC在細(xì)胞因子GM-CSF, IL-4及不同濃度INF-a(0、100、500、700、1000U/ml)共同作用下在體外均可誘導(dǎo)分化成熟DC；不同濃度INF-a均能提高DC分泌的免疫刺激細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ的能力,均能促進(jìn)負(fù)載抗原的DC誘導(dǎo)的異體淋巴細(xì)胞增殖及提高DC介導(dǎo)CTL對(duì)肝癌的殺傷率。在本實(shí)驗(yàn)中,INF-a濃度為700U/ml是誘導(dǎo)培養(yǎng)DC的最適濃度。本實(shí)驗(yàn)將為DC應(yīng)用于臨床提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to investigate the effects of different concentrations of IFN- 偽 on the differentiation, maturation and function of DC derived from human umbilical cord blood, to detect the surface markers and function of DC, and to investigate the killing effect of DC mediated by CTL on hepatoma cells. To evaluate the feasibility of DC culture and the antitumor effect mediated by DC loaded with hepatoma cell freeze-thaw antigen. Methods Mononuclear cells (CBMNC),) isolated from umbilical cord blood were cultured in complete culture medium (RPMI-1640 5% fetal bovine serum) supplemented with GM-CSF (1000U/ml) IL-4 (500U/ml) and different concentrations of INF-a (A to E). CBMNC was induced to differentiate into DC1. The morphology of cells was observed under inverted microscope. Flow cytometry was used to detect the expression of CD14, CD83, CD86, CD40, CD40, CDla and HLA-DR on the surface of DC. The proliferative ability of DC to allogeneic lymphocytes and the killing rate of DC mediated CTL to hepatoma cells were determined by Elisa. The levels of IL-12, IFN-y and IL-10 cytokines in the supernatant of DC were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa). Results under the combined action of cytokine GM-CSF IL-4 and different concentrations of INF-a, most of the cells of 1.CBMNC were still adherent to the wall for 3 days, and some cells formed small colonies, but no dendritic processes were observed. On the 7th day, there were obvious pseudopodial protrusions on the surface of the cells, showing typical dendritic shape. 2. Flow cytometry (FCM) analysis showed that the cells harvested on the 7th day showed high expression of mature DC. The expression rates (%) of INF-a in the first part of the experiment were (95.10 鹵1.53) CD86 (75.11 鹵1.63) and (38.75 鹵1.93) HLA-DR (88.75 鹵1.65) .3, respectively. Within a certain concentration range (0100500700U/ml), the proliferation of allogeneic lymphocytes stimulated by DC induced by INF-a showed an increasing trend (P0.05), in which the OD value of allogeneic lymphocyte proliferation was the highest when the concentration of INF-a was 700U/ml and T:DC=10:1 was the highest (0.485 鹵0.100), compared with other groups. Significant statistical difference (P0.05). 4. In this experiment, when the concentration of INF-a was 700U/ml, DC loaded with SMMC-7721 antigen could induce the highest killing rate (30.1 鹵1.6) of allogeneic CTL to hepatoma cells, which was significantly different from other groups (P0.05). The levels of cytokines in the supernatant of DC were detected by ELISA on the 3rd day (P0.05), but on the 7th day, the levels of IL-12 (37.69 鹵2.67 pg/ml) and IFN-y (49.94 鹵1.35 pg/ml) in group D were significantly higher than those in other groups (P0.05). Group D had the lowest IL-10 content (32.34 鹵2.49 pg/ml), which was significantly different from other groups (P0.05). Conclusion CBMNC isolated from umbilical cord blood can induce differentiation and maturation of DC in vitro under the action of cytokines GM-CSF, IL-4 and different concentrations of INF-a, and different concentrations of INF-a can enhance the ability of IL-12 IFN- 緯 secreted by DCs. Both of them could promote the proliferation of allogeneic lymphocytes induced by DC loaded with antigen and increase the killing rate of CTL mediated by DC. In this experiment, the concentration of INF-a was 700U/ml, which was the best concentration for DC induction. This experiment will provide some experimental basis for the application of DC in clinic.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2148700