【摘要】： 血吸蟲病仍然是一種嚴重危害流行區(qū)人民健康的重要公共衛(wèi)生問題。我國每年要投入大量的人力、物力和財力防治血吸蟲病,雖取得了一定的效果,但由于血吸蟲保蟲宿主多,中間宿主釘螺分布廣且難以消滅,再感染頻繁發(fā)生,血吸蟲病的流行形勢仍十分嚴峻。上世紀70年代吡喹酮的問世,對血吸蟲病具有良好的治療效果,但并不能有效阻斷血吸蟲病的傳播,再感染使化療成本顯得相對昂貴,且大規(guī)模反復化療有產生抗藥性蟲株的潛在危險。因此需發(fā)展血吸蟲病疫苗作為化療的重要補充。由于血吸蟲在終宿主體內不繁殖,只要能產生部分免疫保護作用就可有效降低成蟲負荷,減輕由蟲卵遲發(fā)型超敏反應引起的蟲卵肉芽腫及其纖維化病變所致嚴重病理損害,同時減少蟲卵對環(huán)境的污染,對控制血吸蟲病的流行傳播具有重要意義。DNA疫苗作為一種劃時代的新技術,在抗血吸蟲感染領域已進行了大量研究,顯示了良好的應用前景。本實驗室已構建了日本血吸蟲(中國大陸株)磷酸丙糖異構酶(TPI)和23kDa膜蛋白的DNA疫苗,同時還構建了TPI和日本血吸蟲抗獨特型抗體NP30 CDR3區(qū)6倍重復表位基因(CDR3)6的雙價DNA疫苗,均在動物實驗中取得一定的保護作用,但保護力并不理想,減蟲率均未穩(wěn)定達到50%以上。研究發(fā)現(xiàn),將不同單價抗原分子疫苗直接混合在一起免疫動物,可取得較好的免疫保護效果。近年來,在瘧疾、結核病、AIDS等疫苗的研究中發(fā)現(xiàn),接種DNA疫苗后再用蛋白疫苗進行加強免疫,則體液免疫和細胞免疫的水平均有所升高,產生更好的免疫保護作用。另據報道,體內電穿孔可顯著提高DNA疫苗的體內轉染效率,進而提高抗原基因的表達,增強保護性免疫應答。本研究擬通過制備日本血吸蟲雞尾酒式DNA疫苗和蛋白疫苗,并通過兩者聯(lián)合免疫觀察免疫保護效果;在此基礎上再應用體內電穿孔技術來提高雞尾酒式DNA疫苗的轉染效率,以進一步提高其免疫保護效果,同時對其作用的機理進行初步探討。研究內容主要包括: 一、日本血吸蟲雞尾酒式DNA疫苗和蛋白疫苗聯(lián)合應用增強免疫保護作用的研究 大量制備質粒DNA : pcDNA3.1、pcDNA3.1-SjC23、pcDNA3.1-SjCTPI、pcDNA3.1-(CDR3)6,同時制備重組蛋白SjC23-HD、SjCTPI和NP30。以質粒DNA pcDNA3.1-SjC23、pcDNA3.1-SjCTPI、pcDNA3.1-(CDR3)6等量混合后即為雞尾酒式DNA疫苗;重組蛋白SjC23-HD、SjCTPI和NP30等量混合后即為雞尾酒式蛋白疫苗。70只BALB/c小鼠隨機分為A、B、C、D、E 5組,每組14只。A組為自然感染組;B組(空質粒對照組)每只小鼠分別在第0、3、6周經股四頭肌注射100μl pcDNA3.1質粒DNA;C組(空質粒+雞尾酒式蛋白疫苗組)每只小鼠分別在第0、3、6周經股四頭肌注射100μl pcDNA3.1質粒DNA,第9周每鼠經背部皮下多點注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl福氏完全佐劑(FCA);D組(雞尾酒式DNA疫苗組)每只小鼠分別在第0、3、6周經股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗;E組(雞尾酒式DNA與蛋白疫苗聯(lián)合免疫組)每只小鼠分別在第0、3、6周經股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗,第9周每鼠經背部皮下多點注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl FCA。DNA免疫組末次免疫后4周,蛋白加強組末次免疫后2周,所有小鼠同時經腹部皮膚感染40±1條日本血吸蟲尾蚴。攻擊感染后42 d剖殺,計數成蟲數及肝臟蟲卵數。首次免疫前2 d及感染前2 d分別經尾靜脈采血,分離血清檢測IgG抗體水平、抗體亞類IgG1及IgG2a,感染前2d取小鼠脾臟制備單個脾細胞懸液,檢測脾細胞經刀豆蛋白(ConA)和日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原(SEA)刺激后細胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。結果顯示,檢獲的成蟲數,對照組A組與B組無顯著差異(P 0.05),分別為25.82±3.25和25.30±3.80;相對于對照組(A組),C、D組和E組的減蟲率分別為17.70%、32.88%和45.35%,D組和E組的減蟲率均顯著高于C組(P均0.01),且E組的減蟲率顯著高于D組(P 0.01); C、D組和E組相對于對照組的減卵率分別為9.39%、36.20%和48.54%,D組和E組的減卵率均顯著高于C組(P均0.01),且E組的減蟲率顯著高于D組(P 0.05)。雞尾酒式DNA疫苗、雞尾酒式蛋白疫苗均能誘導小鼠產生特異性IgG抗體,C、D組和E組的A450值分別為1.956±0.005、1.374±0.810、2.162±0.162,與對照組相比,C、D、E組的IgG抗體水平均顯著升高(P均0.01),E組的IgG抗體水平顯著高于C組(P 0.05)和D組(P 0.01),抗體亞類IgG2a/IgG1的比值分別為0.525、1.829和0.712。D、E兩組小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ含量較空質粒對照組均有明顯升高,IL-4則無明顯差異。本實驗表明,雞尾酒式DNA疫苗和蛋白疫苗聯(lián)合應用,具有顯著的正協(xié)同作用,雞尾酒式蛋白疫苗可顯著增強雞尾酒式DNA疫苗的免疫保護作用。 二、體內電穿孔增強日本血吸蟲核酸疫苗免疫保護作用的研究在第一部分實驗研究的基礎上,為進一步提高其免疫保護作用,擬通過采用體內電穿孔的免疫方法,探討該免疫方法在提高免疫保護作用中的效能。 制備雞尾酒式DNA疫苗和雞尾酒式蛋白疫苗同第一部分。70只BALB/c小鼠隨機分為A、B、C、D、E 5組,每組14只。A組為自然感染組;B組(電穿孔空質粒對照組)每只小鼠分別在第0、3、6周經股四頭肌注射100μl pcDNA3.1質粒DNA,每次DNA注射后即輔以體內電穿孔;C組(電穿孔空質粒+雞尾酒式蛋白疫苗組)空質粒免疫與體內電穿孔同B組,但于第9周每鼠經背部皮下多點注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl福氏完全佐劑(FCA);D組(電穿孔雞尾酒式DNA疫苗組)每只小鼠分別在第0、3、6周經股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗,每次DNA疫苗免疫后即輔以體內電穿孔;E組(電穿孔雞尾酒式DNA與蛋白疫苗聯(lián)合免疫組)雞尾酒式DNA免疫與體內電穿孔同D組,但于第9周每鼠經背部皮下多點注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl FCA。DNA免疫組末次免疫后4周,蛋白加強組末次免疫后2周,所有小鼠同時經腹部皮膚感染40±1條尾蚴。攻擊感染后42 d剖殺小鼠,計數成蟲及肝臟蟲卵數。首次免疫前2 d及感染前2 d分別經尾靜脈采血,分離血清檢測IgG抗體水平、抗體亞類IgG1及IgG2a,并取小鼠脾臟制備單個脾細胞懸液,脾細胞經ConA和SEA刺激后,采用流式細胞儀檢測上清中細胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。結果顯示,相對于對照組(A組), C、D和E組的減蟲率分別為18.09%、45.00%和57.09%,D組和E組的減蟲率均顯著高于C組(P均0.01),且E組的減蟲率顯著高于D組(P 0.05);C、D組和E組的減卵率分別為12.49%、50.88%和59.26%,D組和E組的減卵率均顯著高于C組(P均0.01),且E組的減蟲率顯著高于D組(P 0.05)。C、D、E 3組小鼠血清都檢測到特異性IgG抗體,抗體亞類IgG2a/IgG1比值分別為0.394、3.518、0.914。D、E兩組小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ含量較對照組均有明顯升高,IL-4則無明顯差異。本實驗顯示,體內電穿孔技術可顯著提高日本血吸蟲核酸疫苗的免疫保護作用。 三、日本血吸蟲核酸疫苗體內電穿孔法的進一步研究 為進一步探索體內電穿孔技術增強血吸蟲核酸疫苗免疫保護作用的穩(wěn)定性、可靠性及可重復性,為此進行了重復性試驗,以進一步驗證該免疫方法的可行性。 日本血吸蟲“雞尾酒式”DNA疫苗和蛋白疫苗的制備同前。96只5-6周齡的BALB/c雌性小鼠隨機分成A、B、C、D、E、F、G、H 8組,每組12只,其中A組(空質粒對照組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經股四頭肌注射100μl pcDNA3.1質粒DNA;B組(電穿孔空質粒+雞尾酒式蛋白疫苗組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經股四頭肌注射100μl pcDNA3.1質粒DNA,每次DNA疫苗免疫后即輔以體內電穿孔,于第9周每只小鼠經背部皮下多點注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl福氏完全佐劑(FCA);C組(雞尾酒式DNA疫苗組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗;D組(雞尾酒式DNA與蛋白疫苗聯(lián)合免疫組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗,于第9周每只小鼠經背部皮下多點注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl FCA;E組(電穿孔雞尾酒式DNA疫苗組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗,每次DNA免疫后即進行體內電穿孔;F組(電穿孔雞尾酒式DNA與蛋白疫苗聯(lián)合免疫組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗,每次DNA免疫后即進行體內電穿孔,但于第9周每只小鼠經背部皮下多點注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl FCA;G組(TPI組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經股四頭肌注射100μl pcDNA3.1-SjCTPI質粒DNA;H組(電穿孔TPI組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經股四頭肌注射100μl pcDNA3.1-SjCTPI質粒DNA,每次DNA免疫后即進行體內電穿孔。DNA疫苗末次免疫后4周,蛋白疫苗加強免疫后2周,所有小鼠同時經腹部皮膚感染40±1條尾蚴。攻擊感染后42d剖殺小鼠,計數各小鼠成蟲數和肝臟蟲卵數。首次免疫前2 d及感染前2 d分別經尾靜脈采血,分離血清檢測IgG抗體水平、抗體亞類IgG1及IgG2a,并取小鼠脾臟制備單個脾細胞懸液,脾細胞經ConA和SEA刺激后,采用流式細胞儀檢測上清中細胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。結果與上次實驗基本相符,B-H實驗組的減蟲率分別為14.77%、32.54%、43.95%、41.47%、59.38%、27.23%和42.37%,相對于對照組(A組)檢獲的成蟲數均顯著降低(P均0.01),D組(雞尾酒式DNA與蛋白疫苗聯(lián)合免疫組)的減蟲率顯著高于C組(雞尾酒式DNA疫苗組)和B組(電穿孔空質粒+雞尾酒式蛋白疫苗對照組)(P值分別為0.01和0.05),經電穿孔處理后,E組(電穿孔雞尾酒式DNA疫苗組)和H組(電穿孔TPI組)的減蟲率分別顯著高于C組和G組(TPI組)(P值分別為0.05與0.01),而F組(電穿孔雞尾酒式DNA與蛋白疫苗聯(lián)合免疫組)的減蟲率顯著高于D組和E組(P值均0.01);B-H實驗組的減卵率分別為20.62%、44.06%、57.57%、52.83%、67.49%、27.25%和42.75%,相對于對照組各實驗組肝臟內蟲卵數顯著下降(P均0.01),D組的減卵率顯著高于B組和C組(P值分別為0.001和0.05),經體內電穿孔處理后,E組和H組的減卵率分別顯著高于未經電穿孔處理的C組和G組(P值分別為0.05與0.001),F組的減卵率可達67.49%,顯著高于D組和E組(P值均0.05);B-H組的減雌蟲率分別為30.69%、47.19%、62.60%、53.80%、72.28%、35.64%和49.60%,相對于對照組各實驗組的雌蟲數顯著下降(P均0.01),其中D組的減雌率顯著高于B組和C組(P值分別為0.01和0.05),經體內電穿孔處理后,H組較G組的減雌率顯著升高(P0.05),F組的減雌率達72.28%,顯著高于D組和E組(P均0.05)。各實驗組均可檢測到特異性的IgG抗體。經SEA特異性刺激后,各實驗組的IL-2和IFN-γ水平較對照組明顯升高,而IL-4則未檢測到。本研究再次表明, DNA疫苗通過體內電穿孔再結合蛋白疫苗的聯(lián)合應用可較大程度的提高免疫保護作用,減蟲率、減雌率及肝臟的減卵率均達到接近60%和60%以上,表明該免疫方法具有較好的可重復性和穩(wěn)定性,是一種較理想而且可行的血吸蟲病免疫策略。進一步的研究將進行大動物保護性試驗。
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【學位授予單位】：江蘇省血吸蟲病防治研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：2148544