【摘要】： 目的 凋亡抑制因子6(Apoptosis Inhibitor 6,Api6)也叫作AIM或Spα,是清道夫受體富含半胱氨酸殘基家族新成員,在免疫反應、腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用;但作為清道夫受體,Api6在脂質(zhì)代謝中的作用尚未得到深入研究。本研究選用人THP-1單核/巨噬細胞和小鼠RAW264.7巨噬細胞探討①高脂、炎癥狀態(tài)下,兩種巨噬細胞脂質(zhì)蓄積情況;②高脂和/或炎癥狀態(tài)下,清道夫受體SR-A、CD36和Api6在兩種巨噬細胞中的表達;③高脂和/或炎癥狀態(tài)下,核受體LXRalpha、LXRbeta表達與Api6表達的相關(guān)關(guān)系。 材料和方法 1.從人新鮮血漿中提取LDL,氧化制備成oxLDL;采用oxLDL刺激細胞建立高脂模型,采用脂多糖(LPS)刺激細胞建立炎癥模型,油紅O染色觀察巨噬細胞脂質(zhì)蓄積情況。 2.提取Balb/c小鼠腹腔巨噬細胞mRNA,逆轉(zhuǎn)錄擴增獲得Api6cDNA全長,構(gòu)建入pCDNA3.1質(zhì)粒中,獲得可以表達Api6基因的質(zhì)粒pCDNA3.1/Api6。 3.實時熒光定量PCR技術(shù)(real-time quantitative PCR)檢測Api6、CD36、SR-A、LXRalpha、LXRbeta、ABCA1、ABCG1等基因在各種處理條件下,兩種巨噬細胞中mRNA的表達水平。 結(jié)果 1.研究發(fā)現(xiàn)200 ng/ml的LPS和100μg/ml的oxLDL處理可以導致體外培養(yǎng)的兩種巨噬細胞出現(xiàn)異常的脂質(zhì)蓄積。 2.成功構(gòu)建了pCDNA3.1/Api6質(zhì)粒,并對RAW264.7巨噬細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染,使Api6表達上調(diào)了12500倍。 3.高脂情況下,清道夫受體SRA在RAW264.7細胞和THP-1細胞中的表達分別上調(diào)了6倍、2.5倍和6倍、44倍。但同樣處理條件下,Api6在RAW264.7細胞的表達沒有明顯上調(diào);而炎癥和高脂同時存在時,Api6在THP-1細胞中的表達卻上調(diào)了2.7倍。 4. LXR受體激動劑T0901317可以使RAW264.7細胞中LXR的靶基因ABCA1和ABCG1基因表達分別上調(diào)22倍和7倍;THP-1巨噬細胞中ABCA1和ABCG1基因表達均上調(diào)9倍;但LXR受體激動劑T0901317沒有改變Api6在RAW264.7細胞中的表達,Api6在THP-1細胞中的表達則上調(diào)了2倍。Api6在各種處理條件下表達水平的變化趨勢與LXRα的表達水平相關(guān)。 結(jié)論 200 ng/ml的LPS和100μg/ml的oxLDL處理可以導致體外培養(yǎng)的RAW264.7和THP-1細胞出現(xiàn)異常的脂質(zhì)蓄積。炎癥、高脂狀態(tài)下,Api6的表達水平與核受體LXR受體α亞型的表達水平明顯相關(guān);由于缺乏LXRα受體,體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞Api6基礎表達量較低,因此可以作為載體細胞,用以建立過表達Api6的細胞模型深入研究Api6在脂質(zhì)代謝中的作用。
[Abstract]:Objective apoptosis inhibitor 6 (Apoptosis Inhibitor 6 (Api6), also known as AIM or Sp 偽, is a new member of scavenger receptor rich cysteine residue family, which plays an important role in immune response and tumorigenesis. However, the role of Api6 as a scavenger receptor in lipid metabolism has not been further studied. In this study, human THP-1 mononuclear / macrophages and mouse RAW264.7 macrophages were used to investigate 1 hyperlipidemia and 2 hyperlipidemia and / or inflammation. The expression of scavenger receptor SR-AG CD36 and Api6 in macrophages was found to be related to the expression of LXR beta and Api6 under hyperlipidemia and / or inflammation. Materials and methods 1. LDLs were extracted from human fresh plasma and oxidized to form oxLDL.The hyperlipidemia model was established by oxLDL stimulation cells, inflammatory model was established by lipopolysaccharide (LPS) stimulation cells, and lipid accumulation of macrophages was observed by oil red O staining. 2. The Balb/c mouse peritoneal macrophage mRNAs were extracted, the full length of Api6cDNA was obtained by reverse transcription amplification, and the plasmid pCDNA3.1 / Api6.3 was constructed into the pCDNA3.1 plasmid. Real-time fluorescence quantitative PCR (real-time quantitative PCR) was used to detect the expression of mRNA in two kinds of macrophages. Result 1. It was found that 200 ng/ml LPS and 100 渭 g/ml oxLDL could induce abnormal lipid accumulation in two kinds of macrophages cultured in vitro. PCDNA3.1/Api6 plasmid was successfully constructed and transient transfection of RAW264.7 macrophages was carried out. The expression of Api6 was up-regulated by 12500 times. Under hyperlipidemia, the expression of scavenger receptor SRA in RAW264.7 cells and THP-1 cells was increased by 6 times, 2.5 times and 6 times, respectively. However, the expression of Api6 in RAW264.7 cells was not significantly up-regulated under the same treatment condition, but the expression of Api6 in THP-1 cells was increased by 2.7 times when inflammation and hyperlipidemia were present at the same time. LXR receptor agonist T0901317 could up-regulate the expression of ABCA1 and ABCG1 genes of LXR target genes in RAW264.7 cells by 22 times and 7 times respectively. The expression of ABCA1 and ABCG1 genes in THP-1 macrophages were all up-regulated by 9 times. However, LXR receptor agonist T0901317 did not change the expression of Api6 in RAW264.7 cells. However, the expression of Api6 in THP-1 cells increased by 2 times. The change trend of Api6 expression level was related to the expression of LXR 偽 under various conditions. Conclusion 200 ng/ml LPS and 100 渭 g/ml oxLDL could induce abnormal lipid accumulation in cultured RAW264.7 and THP-1 cells. The expression level of Api6 was significantly related to the expression of nuclear receptor LXR receptor 偽 subtype under the condition of inflammation and hyperlipidemia. Due to the lack of LXR 偽 receptor, the basic expression of Api6 in murine macrophage cell line RAW264.7 in vitro was low, so it could be used as carrier cell. To establish a cell model of overexpression of Api6 to study the role of Api6 in lipid metabolism.
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R364.2

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本文編號：2146100