【摘要】： 豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬的DNA病毒,是引起母豬繁殖障礙性疾病的主要病原之一。PPV病自出現(xiàn)至今,在世界各主要養(yǎng)豬國家和地區(qū)廣泛存在,給養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大負(fù)面影響,一直是豬病研究的熱點(diǎn)之一。迄今為止,對PPV抗原結(jié)構(gòu)還不是完全清楚。本研究制備了15株抗PPV的單克隆抗體(McAbs),應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)對效價高、特性好的4株McAbs篩選了對應(yīng)的模擬表位,以期為診斷試劑開發(fā)和表位疫苗研制奠定基礎(chǔ)。 將PPV分離株BQ傳代培養(yǎng)純化后的病毒免疫BALB/c小鼠,取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞在聚乙二醇作用下融合,用間接ELISA法進(jìn)行篩選,以有限稀釋法稀釋擴(kuò)大培養(yǎng),3輪篩選以后得到15株分泌抗PPV的McAbs細(xì)胞株,分別對這些細(xì)胞株進(jìn)行了如下生物學(xué)特性鑒定:染色體計數(shù)發(fā)現(xiàn)其核內(nèi)染色體數(shù)均在80~110條之間,符合雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)規(guī)律;特異性實驗表明該15株McAbs細(xì)胞株,僅特異性地與PPV發(fā)生反應(yīng),而不與其他引起母豬繁殖障礙性疾病的病原:豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬生殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)等發(fā)生交叉反應(yīng);將雜交瘤細(xì)胞按一定量(5×105～5×106個/ml)注射液體石蠟免疫一周后的BALB/c小鼠,制得的腹水抗體效價介于1:2 560～1:20 480之間;單抗亞型鑒定表明所有McAbs均為IgG1亞型,而所有McAbs的輕鏈均為κ型;Western blot結(jié)果顯示15株McAbs中2株針對VP1發(fā)生反應(yīng),12株針對VP2、VP3發(fā)生反應(yīng),還有1株單抗沒有印記。 以15株McAbs中特異性強(qiáng)、效價高且有代表性的識別VP1的C4和識別VP2的E2、B4、F6的4株McAbs分別為配基,從噬菌體隨機(jī)12肽庫中篩選抗體識別的模擬肽。經(jīng)過3輪的淘篩和間接ELISA試驗,獲得了分別與4株McAbs反應(yīng)的陽性噬菌體克隆。經(jīng)測序F6陽性克隆的氨基酸序列高度一致,均為LMGKRRIQRPRI,與VP2有一定同源性;E2和B4陽性克隆與VP2同源性則很低;C4得到了以“-RKR-”為核心序列的VP1抗原模擬表位。動物實驗表明陽性噬菌體免疫BALB/c小鼠可以產(chǎn)生一定的抗體效價。這些模擬表位的獲得為進(jìn)一步分析PPV的結(jié)構(gòu)與功能的研究奠定基礎(chǔ),也可以開發(fā)以表位為基礎(chǔ)的診斷試劑和多表位基因工程疫苗。
[Abstract]:Porcine parvovirus (PPV) is a DNA virus belonging to parvovirus genus of parvovirus family. It is one of the main pathogens causing reproductive disorders in sows. It has brought great negative effect to pig industry and has been one of the hot spots in pig disease research. Up to now, the structure of PPV antigen is not completely clear. In this study, 15 McAbs anti-PPV monoclonal antibodies (McAbs) were prepared. Phage display technique was used to screen the corresponding mimic epitopes of 4 McAbs strains with high titer and good properties, so as to lay a foundation for the development of diagnostic reagents and epitope vaccines. BALB / c mice were immunized with purified PPV virus isolated by passage. Spleen cells and SP2 / 0 cells were fused with polyethylene glycol (PEG) and screened by indirect Elisa. A total of 15 McAbs cell lines secreting anti-PPV were obtained after three rounds of screening by dilution and dilatation with a limited dilution method. The biological characteristics of these cell lines were identified as follows: the chromosome count showed that the number of chromosomes in the nucleus was between 80 and 110. In accordance with the rule of chromosome number of hybridoma cells, the specific experiment showed that the 15 McAbs cells reacted specifically with PPV. But not cross reaction with other diseases causing reproductive disorders in sows: porcine circovirus type 2 (PCV2), porcine pseudorabies virus (PRV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSv). The ascites antibody titers of BALB / c mice immunized with a certain amount (5 脳 10 ~ 5 ~ 5 脳 10 ~ 6 / ml) of liquid paraffin a week after immunization with hybridoma cells were found to be within the range of 1:2 560: 120 480, and all McAbs were identified as IgG1 subtype. The light chain of all McAbs was 魏 -type blot. The results showed that 2 of the 15 McAbs reacted to VP1, 12 of them reacted to VP2VP3, and 1 McAbs had no imprinting. Four McAbs strains with strong specificity, high titer and representative recognition of VP1 and VP2, respectively, were used as ligand. The mimic peptides were screened from phage random 12 peptide library. After three rounds of screening and indirect Elisa tests, positive phage clones which reacted with 4 McAbs strains were obtained. The amino acid sequences of the F6 positive clones were highly consistent, all of them were LMGKRRIQRPRI, and the E2 and B4 positive clones had some homology with VP2, but they had very low C 4 sequence homology with VP2, and the mimic epitopes of VP1 antigen with "-RKR-" as the core sequence were obtained. Animal experiments showed that positive phage immunized BALB / c mice could produce a certain antibody titer. The acquisition of these mimic epitopes lays a foundation for further analysis of the structure and function of PPV, and can also be used to develop epitope based diagnostic reagents and multiepitope genetic engineering vaccines.
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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本文編號：2132658