【摘要】： 目的:人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)-I類分子分布于所有有核細(xì)胞表面,由一條α重鏈(被糖基化的)和一條β2-微球蛋白(β2m)輕鏈非共價(jià)結(jié)合而成。HLA-I類分子可與內(nèi)源性抗原(如細(xì)胞感染病毒后產(chǎn)生病毒蛋白或基因突變產(chǎn)生的突變蛋白)肽結(jié)合,并將其提呈給CD8+ T細(xì)胞,誘發(fā)特異性細(xì)胞殺傷效應(yīng),在機(jī)體抗病毒感染、監(jiān)視和清除體內(nèi)突變細(xì)胞過(guò)程中起著重要的作用。其中,HLA-A、B、C是經(jīng)典的HLA-I類分子。多功能蛋白酶2(large multifunctional protease, LMP2)是組成細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體(proteasome)的亞基之一,能夠?qū)?nèi)源性抗原降解成多肽,后者與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白(transporter associated protein,TAP)相結(jié)合。TAP1是組成TAP的亞單位之一,可以將蛋白酶體產(chǎn)生的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中使之與新合成的HLA-I類分子相結(jié)合,進(jìn)而呈遞至細(xì)胞表面供T細(xì)胞識(shí)別。HLA-I類分子的正常表達(dá)以及內(nèi)源性抗原肽的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)是維持機(jī)體免疫監(jiān)視功能的重要環(huán)節(jié)。有研究表明,一些致癌性的環(huán)境因素可降低正常細(xì)胞表面HLA-I類分子的表達(dá),使細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視作用,為其發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化提供可能。 伏馬菌素B1(FumonisinB1,FB1)是由串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)產(chǎn)生的代謝物,主要污染玉米、小麥、大米及豆類等糧食作物。FB1可以引起馬腦白質(zhì)軟化綜合征、豬肺水腫和鼠肝腎損傷,且其促癌性和致癌性已在大鼠中得到證實(shí)。另外,流行病學(xué)調(diào)查資料顯示,FB1可能與食管癌的發(fā)生有密切關(guān)系。而目前對(duì)FB1的研究多集中在檢測(cè)方法、對(duì)動(dòng)物及其細(xì)胞株的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)上,而對(duì)于人體免疫功能影響的研究國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究擬通過(guò)觀察不同劑量和不同作用時(shí)間的FB1對(duì)體外培養(yǎng)的人胃粘膜上皮GES-1細(xì)胞中經(jīng)典的HLA-I類分子(HLA-A,B,C)、β2m、LMP2和TAP1基因在mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響,以期揭示其對(duì)胃上皮細(xì)胞內(nèi)源性抗原加工、轉(zhuǎn)運(yùn)及表達(dá)的作用及其機(jī)制,為某些消化道腫瘤的治療和預(yù)防提供依據(jù)。 方法:及處理 用含10%胎牛血清,105 U/L青霉素,100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃,5% CO2條件溫箱中體外培養(yǎng)正常人胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-1細(xì)胞,細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(傳代后24h)隨機(jī)分為對(duì)照組和處理組。在劑量和時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中,FB1作用劑量和時(shí)間的設(shè)計(jì)以Neera等人為參考并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在量效研究中,處理組加入FB1,使其終濃度分別為5,10和20μΜ,作用時(shí)間均為24h;在時(shí)效研究中,根據(jù)量效研究結(jié)果選擇20μΜF(xiàn)B1為處理濃度,作用時(shí)間分別為2,6,12,24,36,48和72h,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置相應(yīng)的對(duì)照組。經(jīng)FB1作用后,常規(guī)細(xì)胞刮匙刮除并離心收集細(xì)胞。 2反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)檢測(cè)mRNA的表達(dá) 2.1細(xì)胞總RNA的提取、鑒定及定量采用異硫氰酸胍一步法提取細(xì)胞總RNA。1%瓊脂糖電泳鑒定其完整性。紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。 2.2 RT-PCR方法 應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)不同劑量和不同作用時(shí)間的FB1對(duì)GES-1細(xì)胞HLA-A,B,C、β2m、LMP2和TAP1 mRNA表達(dá)的影響。采用凝膠分析軟件(BIO-LD)進(jìn)行定量分析,各組以目的基因與內(nèi)參照基因GAPDH量的比值來(lái)表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。 3蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)蛋白的表達(dá) 3.1細(xì)胞總蛋白的提取和定量 應(yīng)用預(yù)冷的細(xì)胞胞膜裂解液和胞漿裂解液分別加入收集的細(xì)胞中,以提取細(xì)胞的胞膜蛋白和總蛋白。將提取的蛋白應(yīng)用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。 3.2 Western blot方法 提取的細(xì)胞總蛋白,應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)不同劑量和不同作用時(shí)間的FB1對(duì)GES-1細(xì)胞HLA-A,B,C、β2m、LMP2和TAP1蛋白表達(dá)水平的影響。所檢測(cè)的四種蛋白的分子量分別為43～45 kD、12KD、21～24KD和64KD。 4免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)染色(SP法) 細(xì)胞爬片后,檢測(cè)不同劑量的FB1(0, 5, 10,20μM )處理后GES-1細(xì)胞中HLA-A,B,C、β2m、LMP2和TAP1的表達(dá)情況。 5統(tǒng)計(jì) 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)分析與單因素方差分析(analysis of variance, ANOVA),結(jié)果用x±s表示。 結(jié)果: 1 FB1對(duì)GES-1細(xì)胞HLA-I類分子表達(dá)的影響 1.1 FB1對(duì)GES-1細(xì)胞HLA-I類分子重鏈(HLA-A,B,C)表達(dá)的影響 1.1.1 FB1對(duì)GES-1細(xì)胞HLA-I類分子重鏈HLA-A,B,C表達(dá)的量效作用 RT-PCR結(jié)果顯示:不同濃度的FB1處理后,HLA-A mRNA的相對(duì)表達(dá)量隨作用濃度的升高逐漸降低(r=-0.767,P0.01)。中、高劑量(10μM和20μM)的FB1處理組中,HLA-B mRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組水平(P0.05),而低劑量組(5μM)表達(dá)水平未見(jiàn)明顯改變(P0.05)。 各濃度處理組HLA-C mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組水平相比均未見(jiàn)顯著性差異(P0.05)。 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:不同濃度的FB1處理后,HLA-A,B,C的相對(duì)表達(dá)量隨作用濃度的升高逐漸降低(r=-0.848, P0.01)。 ICC染色結(jié)果也顯示:FB1處理組HLA-A,B,C蛋白的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組水平相比均明顯降低(P0.05)。 1.1.2 FB1對(duì)GES-1細(xì)胞HLA-A,B,C表達(dá)的時(shí)效作用RT-PCR結(jié)果顯示:經(jīng)20μM FB1作用不同時(shí)間后,在24、48、36和72h處理組中,HLA-A mRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于各自的對(duì)照組水平(P0.05);而處理2、6和12h,與對(duì)照組水平相比均無(wú)顯著性差異(P0.05)。其中,2-24h內(nèi),隨處理時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞中HLA-A mRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低(r=-0.792, P0.01);而在24-72h內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高但二者間未見(jiàn)明顯相關(guān)關(guān)系(r=0.334, P0.05)。 HLA-B mRNA的表達(dá)量?jī)H在12、24和36h處理組中顯著低于相應(yīng)的對(duì)照組水平(P0.05)。在2-12內(nèi)隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降(r=-0.683, P0.01);在12-72h內(nèi)隨作用時(shí)間延長(zhǎng)逐漸緩慢趨于升高但未見(jiàn)明顯相關(guān)關(guān)系(r=0.182, P0.05)。在12、24和36h處理組中,HLA-B mRNA的相對(duì)表達(dá)量與相應(yīng)的對(duì)照組水平相比均明顯降低(P0.05)。 在72h內(nèi),20μM FB1作用不同時(shí)間后,HLA-C mRNA的表達(dá)均未見(jiàn)明顯差異(P0.05)。 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:20μM的FB1分別作用12、24、36、48和72h時(shí),HLA-A,B,C蛋白的表達(dá)均明顯低于相應(yīng)的對(duì)照組水平(P0.05);而作用2和6h時(shí)對(duì)HLA-A,B,C蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響(P0.05)。另外,HLA-A,B,C蛋白的相對(duì)表達(dá)量在2-24h內(nèi)隨作用時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸下降趨勢(shì)(r=-0.770, P0.01),隨后在24-72h內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高(r=0.976, P0.01)。 1.2 FB1對(duì)GES-1細(xì)胞β2m表達(dá)的影響 1.2.1 FB1對(duì)GES-1細(xì)胞β2m表達(dá)的量效作用 RT-PCR結(jié)果顯示:各濃度處理組β2m mRNA的相對(duì)表達(dá)量改變與對(duì)照組水平相比均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。蛋白水平上,Western blot及免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果均顯示FB1各劑量處理組β2m表達(dá)量與對(duì)照組水平相比均無(wú)顯著性差異(P0.05)。 1.2.2 FB1對(duì)GES-1細(xì)胞β2m表達(dá)的時(shí)效作用 RT-PCR結(jié)果顯示:在各時(shí)間段內(nèi)β2m mRNA的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組水平相比未見(jiàn)顯著性差異(P0.05)。 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:β2m蛋白的相對(duì)表達(dá)量較之相應(yīng)的對(duì)照組水平未見(jiàn)明顯差異(P0.05)。 2 FB1對(duì)GES-1細(xì)胞LMP2表達(dá)的影響 2.1 FB1對(duì)GES-1細(xì)胞LMP2表達(dá)的量效作用RT-PCR結(jié)果顯示:中、高劑量(10μM和20μM)的FB1處理后,LMP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組水平(P0.05),而低劑量(5μM)組表達(dá)水平未見(jiàn)明顯改變(P0.05)。 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:FB1各劑量處理組LMP2的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組水平相比均具有顯著性差異(P0.05)并且隨處理濃度的升高依次降低(r=-0.812, P0.01)。ICC染色結(jié)果也顯示FB1各處理組LMP2陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為與對(duì)照組水平相比均具有顯著性差異(P0.01)。 2.2 FB1對(duì)GES-1細(xì)胞LMP2表達(dá)的時(shí)效作用 RT-PCR結(jié)果顯示:20μM FB1分別作用12、24、36、48h,LMP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于相應(yīng)的對(duì)照組水平(P0.05);但2、6和72h處理組中LMP2 mRNA的表達(dá)量未見(jiàn)顯著性差異(P0.05)。其中,在2-12h內(nèi)隨作用時(shí)間延長(zhǎng),FB1對(duì)LMP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低(r=-0.452, P0.05);隨后在12-72h內(nèi)LMP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量隨作用時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高(r=0.803, P0.01)。 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:LMP2蛋白的相對(duì)表達(dá)量在12、24和36h時(shí)顯著低于各自的對(duì)照組水平(P0.05),在2、6、48和72h時(shí)其表達(dá)量與各自的對(duì)照組水平相比未見(jiàn)顯著性差異(P0.05)。LMP2蛋白的相對(duì)表達(dá)量在2-24h內(nèi)隨作用時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降(r=-0.972, P0.01),在24-72h內(nèi)逐漸升高但未見(jiàn)有明顯相關(guān)關(guān)系(r=0.061, P0.05)。 3 FB1對(duì)GES-1細(xì)胞TAP1表達(dá)的影響 3.1 FB1對(duì)GES-1細(xì)胞TAP1表達(dá)的量效作用RT-PCR結(jié)果顯示:不同濃度的FB1作用24h后,僅高濃度(20μM)處理組TAP1 mRNA與對(duì)照組水平相比顯著降低(P0.01)。 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:僅中、高濃度(10μM和20μM)FB1處理組TAP1相對(duì)表達(dá)量較之對(duì)照組具有顯著性差異(P0.05);ICC染色結(jié)果對(duì)TAP1蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果亦顯示10μM和20μM處理組具有顯著性差異(P0.01)。 3.2 FB1對(duì)GES-1細(xì)胞TAP1表達(dá)的時(shí)效作用RT-PCR結(jié)果顯示:TAP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在12、24、36和48h時(shí)均顯著低于相應(yīng)的對(duì)照組水平(P0.05),但在2、6和72h時(shí)二者未見(jiàn)顯著性差異(P0.05)。經(jīng)不同作用時(shí)間后,TAP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在2-12h內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降(r=-0.783, P0.05),隨后在12-72h內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高(r=0.679, P0.01)。 Western blot結(jié)果顯示:在12、24、36和48h時(shí)均顯著低于相應(yīng)的對(duì)照組水平(P0.05),但在2、6和72h時(shí)二者未見(jiàn)明顯差異(P0.05)。TAP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量在2-12h內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降(r=-0.860, P0.01),在12-72h內(nèi)則逐漸升高但未見(jiàn)存在明顯相關(guān)關(guān)系(r=0.560, P0.05)。 結(jié)論: 1 FB1能夠在mRNA和蛋白水平上抑制GES-1細(xì)胞HLA-I類分子的表達(dá)。 2 FB1能夠在mRNA和蛋白水平上抑制GES-1細(xì)胞LMP2和TAP1的表達(dá)。 3不同劑量、不同作用時(shí)間的FB1對(duì)GES-1細(xì)胞HLA-C mRNA、β2m mRNA和β2m蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯影響。 4 FB1可能通過(guò)直接抑制HLA-A,B,C蛋白的表達(dá)和/或通過(guò)間接抑制LMP2和TAP1的表達(dá)進(jìn)而降低細(xì)胞表面HLA-I類分子的呈遞和表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

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