【摘要】：第一部分PAO1外膜囊泡的提取的方法學(xué)建立及優(yōu)化 目的：建立并優(yōu)化銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）外膜囊泡（out membrane vesicle,OMV）體外的提取及純化方法，為研究OMV的生物學(xué)活性及誘導(dǎo)感染發(fā)生的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法：以銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)AO1為模式菌，分別采用分別采取超濾濃縮法和Optiripe密度梯度超速離心分離法提取PAO1的外膜囊泡，負(fù)染電鏡檢測形態(tài)及純度；BCA法檢測兩種方法提取的OMV蛋白濃度并計算OMV產(chǎn)量。 結(jié)果：超濾濃縮法提取的OMV含有較多雜質(zhì)，產(chǎn)量為21.3ug/1010個細(xì)菌，密度梯度離心提取的OMV無明顯雜質(zhì)存在，產(chǎn)量為48.7ug/1010個細(xì)菌。 結(jié)論：超濾濃縮法和Optiripe密度梯度超速離心法均可用于提取PA的外膜囊泡，但Optiripe密度梯度離心法提取的OMV的產(chǎn)率和純度均高于超濾濃縮法提取OMV。 第二部分PAO1外膜囊泡的成分及生物學(xué)活性檢測 目的:初步檢測PAO1的OMV中所含蛋白，建立OMV體內(nèi)體外感染模型，檢測OMV的生物學(xué)活性 方法:用SDS-PAGE電泳初步鑒定OMV中所含蛋白條帶，建立OMV感染人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B，ELISA檢測炎性因子IL-6、IL-8的表達(dá)水平；通過滴鼻方式建立OMV感染Bablc小鼠模型，提取小鼠肺組織，HE染色觀察其炎性變化；通過多粘菌素B抵抗實驗，檢測OMV對細(xì)菌的保護(hù)作用。 結(jié)果:SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示PAO1的OMV中含有多種蛋白條帶，主要為10-100KDa大小的蛋白；PAO1的OMV能顯著誘導(dǎo)Base-2B細(xì)胞表達(dá)炎性因子IL-6、IL-8，刺激Balbc小鼠肺組織發(fā)生明顯的炎性變化，且能幫助PAO1抵抗多粘菌素B的殺害。 結(jié)論:PAO1分泌的外膜囊泡為一個含有多種蛋白的混合體，具有誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)以及保護(hù)感染細(xì)菌抵抗周圍不利環(huán)境等多種生物學(xué)活性。 第三部分lasB對PAO1外膜囊泡的影響 目的:探討lasB基因?qū)AO1的OMV的形態(tài)、分泌量、及防御功能的影響。 方法:PCR鑒定PAO1標(biāo)準(zhǔn)株和lasB缺陷的PAO1株，用Optiripe密度梯度超速離心法提取PAO1標(biāo)準(zhǔn)株和lasB缺陷株的外膜囊泡，負(fù)染電鏡觀察兩種外膜囊泡的形態(tài)、BCA法檢測OMV蛋白濃度，計算OMV產(chǎn)率，，通過剛果紅實驗比較兩種外膜囊泡彈性蛋白酶活性大小，建立OMV感染正常人外周血單個核細(xì)胞模型，通過計算細(xì)菌吞噬率檢測OMV保護(hù)細(xì)菌抵抗單個核細(xì)胞吞噬的能力。 結(jié)果:PAO1標(biāo)準(zhǔn)株和lasB缺陷株體外分泌的外膜囊泡形態(tài)一致，均為20-200nm的球形結(jié)構(gòu)。與lasB缺陷株相比，PAO1標(biāo)準(zhǔn)株的OMV產(chǎn)率更高，所具有的彈性蛋白酶活性更強(qiáng)，且?guī)椭?xì)菌抵抗人外周血單個核細(xì)胞吞噬的能力更強(qiáng)。 結(jié)論:lasB缺陷對PAO1體外分泌的外膜囊泡形態(tài)無影響，但lasB缺陷后，外膜囊泡的分泌量、所含彈性蛋白酶活性以及對細(xì)菌的保護(hù)能力均下降。
[Abstract]:Part I Methodology and Optimization of extracellular vesicles of PAO1 objective: to establish and optimize in vitro extraction and purification of Pseudomonas aeruginosa (PA) (out membrane vesicleus. It provides a basis for studying the biological activity of OMV and the mechanism of inducing infection. Methods: PAO1, a standard strain of Pseudomonas aeruginosa, was extracted by ultrafiltration concentration method and Optiripe density gradient ultracentrifugation method, respectively. The morphology and purity of PAO1 were detected by negative staining electron microscope. The concentration of OMV protein extracted by two methods was detected by BCA method and the production of OMV was calculated. Results: the concentration method of ultrafiltration method contained more impurities, the yield was 21.3ug/1010 bacteria, and the density gradient centrifugation method had no obvious impurity, and the yield was 48.7ug/1010 bacteria. Conclusion: both ultrafiltration concentration method and Optiripe density gradient ultracentrifugation method can be used to extract outer membrane vesicles of PA, but the yield and purity of OMV extracted by Optiripe density gradient centrifugation method are higher than that by ultrafiltration concentration method. The second part: detection of components and biological activity of PAO1 outer membrane vesicles objective: to detect the proteins contained in the OMV of PAO1 and to establish an in vivo and in vitro infection model of PAO1. Methods to detect the biological activity of OMV: SDS-PAGE electrophoresis was used to preliminarily identify the protein bands contained in OMV and to establish an Elisa to detect the expression of IL-6 and IL-8 in human bronchial epithelial cells infected with OMV. The Bablc mice model of OMV infection was established by nasal drip, and the inflammatory changes were observed by HE staining in lung tissue of mice, and the protective effect of OMV on bacteria was detected by polymyxin B resistance test. Results the results showed that there were many protein bands in the OMV of PAO1. OMV, which was mainly 10-100 KDa protein, could induce the expression of IL-6 and IL-8 in Base-2B cells, and stimulate the pulmonary tissue of Balbc mice. And can help PAO 1 to resist polymyxin B killing. Conclusion the adventitia vesicles secreted by 1% PAO1 are a mixture of many proteins and have many biological activities such as inducing inflammatory reaction of host cells and protecting the infected bacteria from the unfavorable environment around them. Part 3 effects of lasB on PAO1 adventitia vesicles objective: to investigate the effects of lasB gene on the morphology, secretion and defense function of PAO1. Methods PAO1 standard strain and PAO1 strain with lasB defect were identified by 1% PCR. The outer membrane vesicles of PAO1 standard strain and lasB defective strain were extracted by Optiripe density gradient ultracentrifugation method. The protein concentration of OMV was detected by negative staining electron microscope, and the yield of OMV was calculated. By comparing the activity of two kinds of outer membrane vesicle elastase with Congo red test, the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) model of normal human infected with OMV was established, and the ability of OMV to protect bacteria against mononuclear cell phagocytosis was measured by calculating the phagocytosis rate of bacteria. Results the morphology of adventitia vesicles secreted by the standard strain of 1: PAO1 and the defective strain of lasB in vitro were identical and they were spherical structure of 20-200nm. Compared with the standard strain of lasB, the standard strain of PAO1 has higher yield of OMV, stronger activity of elastase and stronger ability to help bacteria resist phagocytosis of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Conclusion the morphology of adventitia vesicles secreted by PAO1 was not affected by the defect of VlasB, but the secretion of adventitia, the activity of elastase and the ability of protecting bacteria were decreased after the defect of lasB.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378.991

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本文編號：2131909