【摘要】： 胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ES cells)是一群具有多向分化潛能的細(xì)胞,發(fā)育上的全能性賦予其在臨床上廣泛的應(yīng)用前景。對(duì)胚胎干細(xì)胞全能性機(jī)制的研究是其在臨床上得以應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。Nanog是2003年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,特異性的表達(dá)于全能性細(xì)胞中,研究發(fā)現(xiàn)Nanog在胚胎干細(xì)胞的全能性維持、早期分化以及成體細(xì)胞的去分化過程中起至關(guān)重要的作用,但是其具體的作用機(jī)制現(xiàn)在仍未闡明。本研究旨在通過研究Nanog的下游靶基因、上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控、以及其是否參與成體細(xì)胞的去分化過程來闡明Nanog在胚胎干細(xì)胞自我更新中的作用機(jī)制。 本研究的第一部分旨在研究胚胎干細(xì)胞中受Nanog表達(dá)調(diào)控的相關(guān)基因。Nanog作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控下游基因的表達(dá)來發(fā)揮作用,對(duì)這些基因的分析研究能夠更好地了解Nanog在胚胎干細(xì)胞中的作用機(jī)制。我們采用RNA干擾(RNA interference,RNAi)的方法特異性的降低胚胎干細(xì)胞中Nanog的表達(dá),為了得到有效的干擾片斷,我們?cè)O(shè)計(jì)合成了四個(gè)特異性的Nanog干擾片斷以及一個(gè)陰性對(duì)照片斷。從中篩選得到一個(gè)高效的干擾片斷Nanog-siRNA-P1,Western-Blot和Real-Time PCR分析結(jié)果顯示Nanog-siRNA-P1對(duì)Nanog表達(dá)的抑制效率可達(dá)90%。Nanog表達(dá)降低后,胚胎干細(xì)胞呈現(xiàn)分化特征,并伴隨著細(xì)胞增殖能力下降。在用RNA干擾方法沉默Nanog表達(dá)24h和48h后,采用表達(dá)譜芯片篩選變化基因。我們認(rèn)為這些差異表達(dá)基因?yàn)镹anog的相關(guān)下游靶基因,對(duì)這些基因的進(jìn)一步研究分析將有助于我們了解Nanog在ES細(xì)胞全能性維持中的作用機(jī)制。 在本研究的第二部分中,我們觀察了PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)胚胎干細(xì)胞自我更新能力以及Nanog表達(dá)的影響。首先,我們觀察到利用PI3K信號(hào)通路特異性的抑制劑LY294002特異性地抑制PI3K通路的激活后,ES細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的分化狀態(tài),Nanog表達(dá)下降。為了了解PI3K信號(hào)通路在ES細(xì)胞自我更新中的作用是否是通過調(diào)節(jié)Nanog的表達(dá)介導(dǎo)的,我們構(gòu)建了Nanog-GFP融合蛋白表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞,G418篩選后得到過表達(dá)Nanog的ES細(xì)胞(Ex-Nanog-J1)。結(jié)果表明Nanog的過表達(dá)可以使小鼠的ES細(xì)胞在無LIF條件下保持不分化狀態(tài),并可以減弱由于LY294002所引起的ES細(xì)胞分化,但是外源性的Nanog并不能完全逆轉(zhuǎn)這一分化作用。 本研究的第三部分中我們觀察了Nanog在成體細(xì)胞去分化中的作用。大家都知道胚胎干細(xì)胞可以在適宜的條件下向三個(gè)胚層的各種組織細(xì)胞分化,成體細(xì)胞也可以通過細(xì)胞融合(cell fusion)以及成體細(xì)胞核移植(somatic cells nucleartransfer,SCNT)的方法去分化到多能性干細(xì)胞階段。Nanog特異性的表達(dá)于胚胎干細(xì)胞中,并且在胚胎干細(xì)胞的多能性維持中也起重要作用,那么,Nanog是否參與成體細(xì)胞的去分化過程呢?為了研究Nanog在成體細(xì)胞去分化中的作用,我們構(gòu)建了Nanog-GFP融合蛋白表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞,G418篩選得到表達(dá)Nanog的3T3細(xì)胞,觀察到外源性Nanog特異性的表達(dá)于3T3細(xì)胞的細(xì)胞核中,這與Nanog在胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)定位相同。繼而我們觀察了表達(dá)Nanog的3T3細(xì)胞是否向著全能性細(xì)胞轉(zhuǎn)化,鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)并沒有顯著的變化,細(xì)胞周期檢測Nanog可以提高3T3細(xì)胞的S期降低G0/G1期和M期,可以激活Oct4的表達(dá),但是卻未檢測到其它的ES細(xì)胞相關(guān)基因Sox2、Utf1、Ets2的表達(dá)。這些表明Nanog在成體細(xì)胞去分化過程中,可能會(huì)起一定的作用,但是單純的Nanog過表達(dá)并不足以使成體細(xì)胞去分化到全能性細(xì)胞階段。 通過該項(xiàng)研究我們發(fā)現(xiàn):Nanog在胚胎干細(xì)胞的自我更新過程中起至關(guān)重要的作用,作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Nanog通過促進(jìn)全能性相關(guān)基因的表達(dá)以及抑制分化相關(guān)基因的表達(dá)來維持ES細(xì)胞的不分化狀態(tài);PI3K信號(hào)通路參與胚胎干細(xì)胞全能性的維持,利用LY294002(PI3K通路特異性的抑制劑)抑制PI3K通路后誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化。外源性地過表達(dá)Nanog會(huì)削弱由于LY294002引起的分化,但是卻不能完全逆轉(zhuǎn)這一分化作用,這表明PI3K信號(hào)通路在ES細(xì)胞中的作用只有一部分是通過調(diào)節(jié)Nanog的表達(dá)來介導(dǎo);Nanog在成體細(xì)胞的去分化過程中起一定的作用,但是單純的Nanog過表達(dá)并不足以使成體細(xì)胞去分化到全能性干細(xì)胞階段。
[Abstract]:Embryonic stem cells (ES cells) is a group of cells with pluripotent differentiation potential. The developmental omnipotency gives it a wide range of clinical applications. The research on the omnipotent mechanism of embryonic stem cells is the premise and base of its clinical application and the.Nanog is a newly discovered transcription factor in 2003. The study found that Nanog plays an important role in the omnipotent maintenance, early differentiation and dedifferentiation of embryonic stem cells, but its specific mechanism is still not elucidated. The aim of this study is to study the target gene of Nanog, the regulation of the upstream signal transduction pathway and the regulation of the upstream signal transduction pathway. Whether it participates in the dedifferentiation process of adult cells to elucidate the mechanism of Nanog in the self-renewal of embryonic stem cells.
The first part of this study aims to study the role of.Nanog, a related gene regulated by Nanog expression in embryonic stem cells as a transcription factor, to play a role in regulating the expression of downstream genes. The analysis and research of these genes can better understand the mechanism of Nanog in the embryonic stem cells. We use RNA interference (RNA interference). RNAi's method specifically reduced the expression of Nanog in embryonic stem cells. In order to get an effective interference fragment, we designed and synthesized four specific Nanog interference fragments and a negative control fragment. A highly efficient interference fragment Nanog-siRNA-P1 was screened from it, and the Western-Blot and Real-Time PCR analysis results showed Nanog-. The inhibition efficiency of siRNA-P1 on the expression of Nanog could reach the decrease of 90%.Nanog expression, and the embryonic stem cells showed differentiation characteristics and decreased with the cell proliferation ability. The expression gene chip was used to screen the change genes after Nanog expression of 24h and 48h with RNA interference method. We think these differentially expressed genes are the related downstream target genes of Nanog. Further analysis of these genes will help us understand the mechanism of Nanog in the maintenance of ES cell totipotency.
In the second part of this study, we observed the effect of PI3K signal transduction pathway on the self-renewal capacity of embryonic stem cells and the expression of Nanog. First, we observed that ES cells showed distinct differentiation and Nanog expression decreased after the specific inhibition of the activation of the PI3K pathway by the specific inhibitor LY294002 of the PI3K signaling pathway. In order to understand whether the role of PI3K signaling pathway in ES cell self renewal is mediated by regulating the expression of Nanog, we constructed a Nanog-GFP fusion protein expression vector and transfected ES cells. G418 screened the ES cells expressing Nanog (Ex-Nanog-J1) after G418 screening. The results showed that the overexpression of Nanog could make ES cells in mice without LIF. The condition remained undifferentiated and weakened the differentiation of ES cells induced by LY294002, but exogenous Nanog did not completely reverse this differentiation.
In the third part of this study, we observed the role of Nanog in the dedifferentiation of adult cells. It is known that embryonic stem cells can differentiate into various tissue cells of the three germ layers under suitable conditions, and adult cells can also pass cell fusion (cell fusion) and adult somatic cells nucleartransfer (SCNT). .Nanog specifically expresses in embryonic stem cells and plays an important role in the pluripotent maintenance of embryonic stem cells. Then, does Nanog participate in the dedifferentiation process of adult cells? In order to study the role of Nanog in the dedifferentiation of adult cells, we constructed a Nanog-GFP fusion. Protein expression vector, and transfection of 3T3 cells, G418 screening 3T3 cells expressing Nanog, the expression of exogenous Nanog specifically expressed in the nucleus of 3T3 cells, which is the same as the expression of Nanog in the embryonic stem cells. There is no significant change in cell morphology. Cell cycle detection Nanog can increase the S phase of 3T3 cells to decrease G0/G1 and M phase, and can activate Oct4 expression, but no other ES cell related genes Sox2, Utf1, Ets2 expression are not detected. These indicate that Nanog may play a role in the process of adult cell segregation, but simple but simple. Overexpression of Nanog is not enough to dedifferentiate adult cells into totipotent cells.
We found that Nanog plays a vital role in the self-renewal process of embryonic stem cells. As a transcription factor, Nanog maintains the undifferentiated state of ES cells by promoting the expression of omnipotent related genes and inhibiting the expression of differentiation related genes, and the PI3K signaling pathway participates in the omnipotent of embryonic stem cells. Maintain, use LY294002 (PI3K pathway specific inhibitor) to inhibit the differentiation of ES cells after PI3K pathway. Exogenous overexpression of Nanog weakens the differentiation due to LY294002, but does not completely reverse this differentiation, which indicates that only part of the role of PI3K signaling pathway in ES cells is by regulating the expression of Nanog. To mediate, Nanog plays a role in the dedifferentiation of adult cells, but simple Nanog overexpression is not sufficient to dedifferentiate adult cells into an omnipotent stem cell stage.
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2130713