發(fā)布時(shí)間：2018-07-14 20:38

【摘要】： 目的:構(gòu)建pAT28+efaA+His重組子和腸球菌efaA-對(duì)照株及efaA+轉(zhuǎn)化株,為進(jìn)一步探討efaA基因的功能,防治腸球菌感染奠定基礎(chǔ)。 方法: 一、腸球菌efaA-對(duì)照株及efaA+轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建及鑒定: 1.用PCR從腸球菌標(biāo)本中篩選出efaA-/gel-/cyl-野生株(本實(shí)驗(yàn)室保存); 2.用氯化鈣共沉淀法將空質(zhì)粒pAT28轉(zhuǎn)化到野生株作為對(duì)照株; 3.構(gòu)建pAT28+efaA重組子并轉(zhuǎn)化到野生株做為轉(zhuǎn)化株:Genebank中獲得efaA基因全長(zhǎng),PCR擴(kuò)增efaA基因片段,用基因克隆技術(shù)構(gòu)建pAT28+efaA重組載體,用氯化鈣共沉淀法將重組子轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α,經(jīng)藍(lán)白斑篩、PCR鑒定、雙酶切鑒定、測(cè)序,將測(cè)序正確的重組子轉(zhuǎn)化到野生株做為轉(zhuǎn)化株, IPTG誘導(dǎo)efaA基因表達(dá), SDS-PAGE、Western Blot分析鑒定。 二、efaA基因?qū)δc球菌生物膜形成影響的初步探討 用半定量可見(jiàn)光測(cè)定OD值的方法檢測(cè)efaA-野生株、空質(zhì)粒pAT28對(duì)照株以及efaA+轉(zhuǎn)化株(大約5×106-10×106 CFU)在96孔板分別靜止培養(yǎng)3 h、24 h后形成的生物膜OD595 ,通過(guò)比較efaA基因轉(zhuǎn)化入腸球菌野生株前后生物膜形成能力差異,探討efaA基因?qū)ι锬ば纬傻挠绊憽?結(jié)果:1.對(duì)照株(空質(zhì)粒pAT28轉(zhuǎn)野生株)在含壯觀霉素(終濃度500μg/ml)的ELB培養(yǎng)平板上培養(yǎng)可見(jiàn)菌落生長(zhǎng);轉(zhuǎn)化株(pAT28+efaA重組子轉(zhuǎn)野生株)在IPTG/X-Gal的壯觀霉素(終濃度500μg/ml) ELB培養(yǎng)平板上培養(yǎng),可見(jiàn)白色菌落生長(zhǎng),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE、Western Blot分析,可見(jiàn)在35 kd附近有一條帶;2.早期黏附測(cè)定與生物膜形成實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)化株粘附在96-孔板底部形成的生物膜OD595值均比野生株及對(duì)照株大。 結(jié)論:1.成功構(gòu)建出腸球菌efaA-對(duì)照株及efaA+轉(zhuǎn)化株;2. efaA基因有利于腸球菌早期黏附與生物膜形成。
[Abstract]:Objective: to construct pAT28 efaA his recombinant strain, Escherichia coli EFA A- control strain and efaA transformation strain, so as to further study the function of efaA gene and lay a foundation for prevention and treatment of Enterococcus infection. Methods: 1. Construction and identification of Escherichia coli EFA A-control strain and efaA transformation strain: 1. The wild strains of EFA-r-gel-r-cyl- (preserved in our laboratory) were screened by PCR from Enterococcus specimens; 2. The empty plasmid pAT28 was transformed into wild strain by calcium chloride coprecipitation method. The recombinant plasmid pAT28 efaA was constructed and transformed into wild strain as strain: Genebank. The full-length efaA gene fragment was amplified by PCR. The recombinant vector pAT28 efaA was constructed by gene cloning technique. The recombinant plasmid was transformed into E. coli DH5 偽 by calcium chloride coprecipitation. The recombinant was identified by PCR, double enzyme digestion and sequencing. The recombinant was transformed into wild strain as transformed strain. IPTG induced efaA gene expression and identified by SDS-PAGEG Western blot. Preliminary study on the effect of DianefaA gene on the biofilm formation of Enterococcus spp. The OD value of Escherichia coli was measured by semi-quantitative visible light. Blank plasmid pAT28 control strain and efaA transformation strain (about 5 脳 106-10 脳 106CFU) were cultured at 96-well plate for 3 h or 24 h respectively to form biofilm OD595. The ability of biofilm formation was compared before and after efaA gene was transformed into wild strains of Enterococcus. To investigate the effect of efaA gene on biofilm formation. The result is 1: 1. The control strain (blank plasmid pAT28 transformed wild strain) was cultured on the ELB plate containing spectinomycin (final concentration 500 渭 g/ml), and the transformed strain (pAT28 efaA recombinant transformed wild strain) was cultured on the IPTG- X-Gal spectinomycin (final concentration 500 渭 g/ml) ELB plate. The growth of white colony and the expression of SDS-PAGEG by IPTG were analyzed by Western blot, and a band 2 was found near 35kd. In the early adhesion assay and biofilm formation test, the OD595 values of the biofilm formed at the bottom of the 96-hole plate were larger than those of the wild strain and the control strain. Conclusion 1. E.coli EFA-control strain and efaA transformation strain were successfully constructed. The efaA gene was beneficial to the early adhesion and biofilm formation of Enterococcus.
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R378.1

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本文編號(hào)：2122877