【摘要】： 隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種引起人和動物腹瀉的重要的寄生性原蟲,由其引起的隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)是重要的公共衛(wèi)生問題。目前尚無理想預(yù)防隱孢子蟲病的疫苗。本研究采用新生犢牛小腸上皮細(xì)胞對本室構(gòu)建的微小隱孢子蟲cDNA核糖體展示文庫進行篩選,獲得新的微小隱孢子蟲粘附相關(guān)蛋白基因,并用分子生物學(xué)方法對其進行了原核表達(dá),進而免疫BALB/c小鼠研究其免疫保護力,通過免疫熒光技術(shù)對重組蛋白進行定位。應(yīng)用DNA重組技術(shù)將該基因克隆入真核表達(dá)載體,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,驗證其在真核細(xì)胞中的表達(dá),同時進行動物保護性試驗,觀察重組質(zhì)粒的免疫保護力。結(jié)果成功的篩選到一個新的微小隱孢子蟲粘附蛋白相關(guān)基因,并將其命名為CP16。測序結(jié)果顯示CP16長度為525bp,含有一大小為423bp的開放閱讀框,由ScanProsite與InterProScan分析推測的氨基酸序列,71-93氨基酸是跨膜區(qū)包含一個跨膜區(qū),一個N端糖基化位點。構(gòu)建了微小隱孢子蟲粘附相關(guān)蛋白基因CP16的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-CP16,并轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)后獲得了表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在。免疫熒光檢測證實CP16蛋白位于子孢子表膜和卵囊壁表面。動物試驗結(jié)果顯示重組CP16蛋白具有一定的保護力,減蟲率可達(dá)51.17%。構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒在Hela細(xì)胞中表達(dá)成功;應(yīng)用pVAX1-CP16免疫BALB/c小鼠,結(jié)果表明可誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。試驗組小鼠血清中IgG滴度隨免疫次數(shù)增加而逐漸升高,三免后實驗組IgG滴度與對照組相比差異極顯著(P0.01)。試驗組小鼠的CD4+ T淋巴細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+ T淋巴細(xì)胞數(shù)的值與對照組相比差異顯著(P0.05)。小鼠免疫后經(jīng)口接種微小隱孢子蟲卵囊,試驗組與對照組相比卵囊排出量明顯減少,免疫組減蟲率可達(dá)到58.68%。將pVAX1-CP16經(jīng)鼻粘膜接種妊娠山羊,并對免疫山羊的后代進行攻蟲試驗。結(jié)果表明重組質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)母羊產(chǎn)生免疫反應(yīng),隨著免疫次數(shù)的增加抗體滴度逐漸增加,試驗組與對照組相比差異顯著(p0.05)。羔羊免疫后經(jīng)口接種微小隱孢子蟲卵囊,與對照組相比試驗組羔羊每天排出卵囊數(shù)量明顯減少,排卵囊持續(xù)時間較短,減蟲率達(dá)到56.1%。
[Abstract]:Cryptosporidium (Cryptosporidium) is an important parasitic protozoa causing human and animal diarrhea. The Cryptosporidium disease (Cryptosporidiosis) caused by the Cryptosporidium is an important public health problem. There is no ideal vaccine to prevent Cryptosporidium. This study uses the small cryptospore constructed by the small intestinal epithelial cells of newborn calves. The cDNA ribosome display library was screened to obtain a new gene for the adhesion related protein of Cryptosporidium parvum, and its prokaryotic expression was expressed by molecular biological methods. Then the immune protective ability of BALB/c mice was studied. The recombinant protein was located by immunofluorescence technology, and the gene was cloned by DNA recombination technology. The recombinant plasmid was transfected into Hela cells to verify its expression in the eukaryotic cells. At the same time, the protective test of the recombinant plasmid was carried out and the immune protection of the recombinant plasmid was observed. A new gene of the adhesion protein of Wei Xiaoyin Sporozoa was successfully screened and named as CP16. sequencing results, the length of CP16 was 525bp, An open reading frame with a size of 423bp was used to analyze the sequence of amino acids conjectured by ScanProsite and InterProScan. The 71-93 amino acid was a cross membrane region containing a transmembrane region and a N end glycosylation site. The prokaryotic expression of pET-28a-CP16 of the expression of CP16 of the adhesion related protein gene of Cryptosporidium was constructed, and Rosetta (DE3) was converted to Rosetta (DE3). The expression products were expressed in inclusion body form. Immunofluorescence detection showed that the CP16 protein was located on the surface of the sporozoite membrane and the oocyst wall. The experimental results showed that the recombinant CP16 protein had certain protective ability. The eukaryotic expression plasmid constructed by the worm reduction rate of 51.17%. was successful in the Hela cells; pVAX1-CP16 immunized with BALB/c mice. The results showed that the humoral and cellular immune responses were induced. The IgG titer in the test group increased with the increase of the number of immune times. The IgG titer of the experimental group was significantly different from that of the control group (P0.01). The value of the number of CD4+ T lymphocytes and the number of CD4+/CD8+ T lymphocytes in the experimental group was significantly different from that of the control group. (P0.05). The mice immunized with the oocyst of Cryptosporidium parvum after immunization, compared with the control group, the amount of oocyst excretion decreased significantly compared with the control group. The rate of worm reduction in the immune group could reach 58.68%. by inoculating pVAX1-CP16 through the nasal mucosa and carrying out the attack test on the offspring of the immune goats. The results showed that the recombinant plasmid could induce the immune reaction of the ewes. As the number of immunization increased gradually, the test group had a significant difference compared with the control group (P0.05). The lambs were inoculated with the oocyst of Cryptosporidium parvum after immunization. Compared with the control group, the number of oocyst excreted per day in the experimental group decreased significantly, the duration of ovulation sac was shorter and the rate of worm reduction reached 56.1%..
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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本文編號：2122706