本文選題：p53 + RASSF1A　； 參考：《武漢大學》2009年博士論文

【摘要】：原癌基因和抑癌基因共同調控細胞的增殖和凋亡,本研究證實腫瘤抑制基因p53拮抗另一個腫瘤抑制基因RASSF1A(RAS相關區(qū)域家族蛋白1A),通過作用于RASSF1A啟動子抑制其表達。p53對RASSF1A的抑制調控了細胞凋亡。Intersex是中介體復合物的一個新亞基,同RASSF1A一樣可與微管蛋白α-tubulin結合。蛋白互作研究表明RASSF1A可與Intersex蛋白相互作用。而且,RASSF1A與Intersex的相互作用引起Intersex蛋白在癌癥細胞內的彌散,表明RASSF1A可發(fā)揮交通工具的作用沿著微管來運輸Intersex蛋白。此外,我們還發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動子區(qū)的CG島具有最高啟動活性并且在睪丸癌病人中發(fā)生了高甲基化。RASSF1A啟動子的高甲基化導致了腫瘤病人RASSF1A的表達沉默。我們在睪丸腫瘤的組織芯片中發(fā)現(xiàn)p53、RASSF1A和Intersex三種蛋白具有共定位及定位變化特征,進一步揭示了p53-RASSF1A-Intersex之間的相互作用。這些結果提示p53可通過與RASSF1A之間的互作關系及RASSF1A-Intersex通路調控癌癥的發(fā)展。我們的研究為認識腫瘤抑制基因之間的拮抗提供了一個新的起點。 1. RASSF1A基因啟動子在睪丸腫瘤中發(fā)生高甲基化,導致表達降低 生殖系統(tǒng)腫瘤是嚴重危害生命健康,降低人類生活質量的常見惡性腫瘤,而睪丸癌是年輕男性最常見的惡性腫瘤,病死率高,預后很差。RASSF1A基因的表達失活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。最近研究證實RASSF1A在人類腫瘤包括生殖系統(tǒng)腫瘤中很少突變,啟動子高甲基化是RASSF1A表達失活的主要機制。為了研究RASSF1A啟動子在睪丸癌中是否發(fā)生了高甲基化及其對表達的影響,我們對RASSF1A啟動子進行了分析�？寺×瞬煌L度的RASSF1Apro-EGFP載體,通過細胞轉染和流式細胞術,證實距ATG(+1)上游301bp的部分具有最高啟動活性,并對這一區(qū)域進行了甲基化島分析,通過甲基化特異性PCR(MSP)技術,證實了在睪丸腫瘤中RASSF1A啟動子發(fā)生了高甲基化,測序結果進一步證實了高甲基化狀態(tài)并分析了所包括的16個CpG位點的具體甲基化狀況。進一步通過免疫組織化學技術,檢測到RASSF1A啟動子的甲基化導致了其在睪丸癌中的表達降低,說明RASSF1A腫瘤抑制基因的甲基化失活對腫瘤的發(fā)生具有重要意義。 2.p53蛋白結合到RASSF1A啟動子并下調其表達 我們預測到在RASSF1A啟動子的-2781處存在p53的結合位點。通過構建p53的原核表達載體,原核表達并純化該蛋白,Gel-shift和電泳遷移率變動試驗(EMSA)結果顯示p53可以結合到RASSF1A的靶位點。p53和RASSF1A pro-EGFP瞬時共轉Cos7細胞顯示p53可顯著降低EGFP表達。將p53瞬時轉染內源表達RASSF1A的Siha細胞,Western blot結果顯示RASSF1A表達明顯降低。以上結果說明p53可以結合到RASSF1A啟動子區(qū)域并下調其表達。 3. HPV16-E6 RNAi通過p53下調RASSF1A表達 HPV感染是睪丸癌、宮頸癌、前列腺癌等生殖系統(tǒng)腫瘤的最大易感因素,其中,高危型HPV16和HPV18更是在生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、進展和遷移中起著重要作用。HPV16和HPV18主要編碼E6和E7原癌蛋白,通過p53和Rb參與腫瘤發(fā)生。E6與p53結合后使之降解失活,破壞了p53介導的細胞對DNA損傷的反應,抑制了細胞周期G1/S節(jié)點,同時也抑制p53介導的細胞凋亡。HPV16-E6與RASSF1A之間是否存在聯(lián)系一直沒有明確。通過構建HPV16-E6RNAi載體,瞬時轉染HPV16表達細胞Siha, Western blot和實時熒光定量PCR(real-time PCR)顯示HPV16-E6表達顯著降低,p53表達升高,RASSF1A表達降低。結果表明HPV16-E6可以通過p53調節(jié)RASSF1A表達。 4.p53誘導細胞凋亡改變,并通過RASSF1A進行負調控 p53和RASSF1A均是腫瘤抑制基因,p53與RASSF1A相互作用并下調后者表達引發(fā)一個有趣的問題：如果將p53超表達到RASSF1A內源表達細胞后會引起怎樣的生物學效應?基于此,我們轉染RASSF1A、p53和RASSF1A-siRNA入Siha細胞進行凋亡分析。流式結果顯示：RASSF1A-siRNA可以抑制凋亡,單轉RASSF1A和p53時凋亡明顯增加,共轉RASSF1A和p53與單轉p53相比凋亡并未明顯升高。結果表明,RASSF1A和p53可以引起明顯的凋亡,但由于RASSF1A水平的降低,由其引發(fā)的凋亡效應降低,負反饋調節(jié)由p53引發(fā)的生物學功能,使細胞不至于過度死亡而維持相對穩(wěn)定。 5. RASSF1A與Intersex相互作用并參與Intersex蛋白運輸 我們發(fā)現(xiàn)RASSF1A與Intersex基因相互作用并參與其蛋白運輸功能。構建了Intersex-dsRED載體并與RASSF1A-EGFP共轉染Cos7細胞,共聚焦熒光顯微鏡顯示Intersex的定位發(fā)生了明顯改變。單轉時位于細胞核膜胞質面,呈聚集狀態(tài),而與RASSF1A共轉后則彌漫性分布于胞漿。免疫共沉淀技術證實Intersex與RASSF1A之間存在相互作用。進一步發(fā)現(xiàn)Intersex可與a-tubulin共定位于微管,免疫共沉淀證實了這種相互作用,破壞微管后Intersex的蛋白運輸受到抑制,提示RASSF1A的微管結合和穩(wěn)定功能參與了Intersex的蛋白運輸。 6. HPV16-E6-p53-RASSFIA-Intersex 綜合以上結果,我們證實在生殖系統(tǒng)腫瘤中存在這樣一條調控凋亡的通路：p53-RASSF1A-Intersex。p53作用于RASSF1A并下調后者表達,共同調控細胞的凋亡,HPV16-E6促發(fā)腫瘤的機制可能是通過p53參與此通路,RASSF1A與Intersex、α-tubulin共定位于微管,相互作用并參與Intersex蛋白運輸,p53通過與RASSF1A啟動子結合來參與此通路,并最終調控凋亡。
[Abstract]:The interaction between RASSF1A and Intersex leads to the expression of RASSF1A in cancer cells . The interaction between RASSF1A and Intersex leads to the expression of RASSF1A in cancer cells .

1 . The RASSF1A gene promoter is highly methylated in the testis tumor , resulting in decreased expression

RASSF1A promoter was characterized by methylation specific PCR ( MSP ) technique .

2 . p53 protein binds to the RASSF1A promoter and downregulates its expression

p53 and RASSF1A pro - EGFP transient corotation Cos7 cells showed that p53 could significantly decrease the expression of RASSF1A .

3 . HPV16 - E6 RNAi Down - regulation of RASSF1A Expression by p53

HPV infection is the most susceptible factor for germ cell tumors such as testicular cancer , cervical cancer , and prostate cancer . HPV 16 and HPV18 play an important role in the pathogenesis , progression and migration of reproductive system tumors . HPV 16 and HPV18 mainly encode E6 and E7 proto - oncoproteins .

4 . p53 - induced apoptosis changes and negative regulation via RASSF1A

The results showed that RASSF1A - siRNA could inhibit the apoptosis of RASSF1A , p53 and RASSF1A - siRNA .

5 . RASSF1A interacts with Intersex and participates in Intersex Protein Transportation

We found that RASSF1A interacts with the Intersex gene and is involved in its protein transport function . The Intersex - dsRED vector is constructed and co - transfected with RASSF1A - EGFP . The confocal fluorescence microscope shows the interaction between Intersex and RASSF1A .

6. HPV16-E6-p53-RASSFIA-Intersex


Taken together the above results , we have confirmed that there is a way to regulate apoptosis in the tumor of reproductive system : p53 - RASSF1A - Intersex . p53 acts on RASSF1A and down - regulates the expression of the latter , co - regulates the apoptosis of the cells . The mechanism of HPV16 - E6 - promoting tumor may be involved in this pathway by p53 . The mechanism of RASSF1A and Intersex , 偽 - cyclodextrin is located in microtubules , interacting and participating in Intersex protein transport , and p53 is involved in this pathway by binding to the RASSF1A promoter and ultimately regulates apoptosis .
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R363

【共引文獻】

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1 李小颯;LRPPRC在胃癌發(fā)生發(fā)展中的功能研究[D];第四軍醫(yī)大學;2014年

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本文編號：2108598