本文選題：肺炎鏈球菌 + HMGS�。� 參考：《華中師范大學(xué)》2008年博士論文

【摘要】： 肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是引起腦膜炎、菌血癥、肺炎等疾病的主要致病菌,近年來由于環(huán)境污染和抗生素的亂用而造成多藥抗性的肺炎鏈球菌菌株逐年增加,抗性逐年增強(qiáng)。深入研究肺炎鏈球菌等革蘭氏陽性球菌致病機(jī)理和代謝過程十分重要,將為新的抗生素研發(fā)提供新的作用位點或靶標(biāo)�，F(xiàn)代微生物學(xué)研究表明甲羥戊酸的代謝過程是肺炎鏈球菌等革蘭氏陽性球菌生長所必需的,甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway)是一種潛在的藥物作用靶標(biāo)。我們選擇HMG-CoA合成酶和HMG-CoA還原酶作為靶酶,研究其抑制劑影響肺炎鏈球菌正常生理代謝的作用機(jī)理,從而阻止病原菌賴以生存的甲羥戊酸代謝途徑。 本研究以肺炎鏈球菌為材料,采用基因工程技術(shù)克隆表達(dá)了肺炎鏈球菌HMG-CoA合成酶(HMGS)和HMG-CoA還原酶(HMGR)基因,進(jìn)行了動力學(xué)特性和功能研究。同時,構(gòu)建了肺炎鏈球菌HMG-CoA合成酶和HMG-CoA還原酶三維空間結(jié)構(gòu)模型,利用篩選抑制劑生物活性檢測方法對用分子對接技術(shù)和網(wǎng)格計算技術(shù)在化合物數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行高通量虛擬篩選出的抗生素先導(dǎo)化合物進(jìn)行了實際篩選。本文主要得到以下研究結(jié)果: 1.從肺炎鏈球菌基因組DNA中克隆了HMGS基因,基因序列分析表明:該基因與文獻(xiàn)中報道的肺炎鏈球菌HMGS基因(No.AF290098)相比較有98.5%的同源性,存在18個核苷酸的差異,其中有2個核苷酸的不同導(dǎo)致編碼的氨基酸改變,分別是Asn259→Ser,Ala349→Val。將HMGS基因亞克隆到pET-28未能正常表達(dá),分析發(fā)現(xiàn)在第226核苷酸處A突變成T,導(dǎo)致形成了終止密碼子。通過對T226進(jìn)行反突變,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-HMGSm并成功表達(dá)。該基因編碼蛋白由398個氨基酸組成。 2.通過優(yōu)化重組HMGS的表達(dá)條什,在18℃0.4mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h,利用Ni-NTA層析柱分離純化得到了46kDa特異性蛋白(重組HMGS)。重組肺炎鏈球菌HMGS酶學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn):該酶最適pH 9.75,最適MgCl_2濃度為10mM/mL,最適溫度37℃。粗酶提取物的比活為0.76μmol/min/mg,分離純化后比活為3.24μmol/min/mg,比活提高4.26倍。動力學(xué)分析表明:該酶Vmax和Km分別為4.69μmol/min/mg和Km為213μM。 3.從肺炎鏈球菌基因組DNA中克隆了HMGR基因,該基因與文獻(xiàn)中報道的肺炎鏈球菌HMGR基因(No.AF290098)相比較有99.9%的同源性,存在7個核苷酸的差異,其中有3個核苷酸的不同引起編碼氨基酸的改變,分別是Glu44→Val,Asn46→Asp,Gly72→Glu。該基因編碼蛋白由424個氨基酸組成。構(gòu)建了克隆重組表達(dá)載體pET-HMGR,在30℃經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá),Ni-NTA層析柱分離純化后獲得了47kDa的特異性蛋白。動力學(xué)分析表明肺炎鏈球菌HMGR的最適pH 6.5,最適溫度37℃。粗酶提取物的比活為11.22μmol/min/mg,分離純化后比活為31.98μmol/min/mg,比活捉高2.8倍。在37℃,pH 6.5時的Vmax和Km分別為62.1μmol/min/mg和260μM。用表達(dá)純化后的HMGR蛋白免疫新西蘭大白兔,提取抗血清,ELISA檢測其效價為1:320,000,Western雜交進(jìn)一步證明HMGR具有較高的免疫學(xué)活性。 4.以糞腸球菌HMGS和假單胞菌HMGR晶體結(jié)構(gòu)為模板,通過SYBYL7.0軟件,成功地構(gòu)建了鏈球菌HMGS利HMGR的同源模建。采用計算機(jī)分析三維結(jié)構(gòu),用同源模建的方法尋找結(jié)構(gòu)類似物來研究新藥的開發(fā)是一個新的領(lǐng)域。本研究分析了肺炎鏈球菌HMGS和HMGR的三維結(jié)構(gòu),根據(jù)其同源模建和三維結(jié)構(gòu),利用分子對接技術(shù)和網(wǎng)格計算技術(shù)在化合物數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行高通量虛擬篩選競爭性抑制劑。 5.建立了采用重組肺炎鏈球菌HMGR篩選抑制劑苗頭化合物的生物活性檢測方法。對利用分子對接技術(shù)和網(wǎng)格計算技術(shù)在化合物數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行高通量虛擬篩選出的30種苗頭化合物進(jìn)行了實際篩選。初步分析結(jié)果表明:在候選的30種苗頭化合物中,篩選到一種比傳統(tǒng)的競爭性抑制劑洛伐它汀具有更佳抑制效果的10號抑制劑,其抑制常數(shù)Ki為76μM,而洛伐它汀的抑制常數(shù)Ki為353μM。篩選到的該化合物通過進(jìn)一步的藥理、毒理、臨床研究,有望研發(fā)成為治療革蘭氏陽性球菌的新藥物。 6.洛伐它汀是HMGR的競爭性抑制劑,對肺炎鏈球菌HMGR具有一定的抑制效果,而洛伐它汀對HMGS幾乎沒有抑制作用。重組HMGR篩選苗頭化合物使用的底物HMG-CoA費用昂貴,極大地限制了實際篩選,通過克隆表達(dá)的重組HMGS酶促反應(yīng)的產(chǎn)物代替HMG-CoA進(jìn)行苗頭化合物篩選效果較好。重組HMGS酶促反應(yīng)的產(chǎn)物可以對大量候選的苗頭化合物進(jìn)行初篩,可降低篩選成本,有利于尋找新型高效抑制先導(dǎo)化合物,為研發(fā)可用于治療肺炎、腦膜炎、敗血癥、菌血癥等疾病的新型抗生素先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ)。新型高效抗生素藥物一旦研發(fā)成功,將有著良好的應(yīng)用前景。
[Abstract]:Streptococcus pneumoniae ( Streptococcus pneumoniae ) is the main pathogenic bacterium causing meningitis , bacteraemia , pneumonia and other diseases . In recent years , the strain of Streptococcus pneumoniae caused by the disorder of environmental pollution and antibiotics has been increasing year by year . The pathogenesis and metabolic process of Gram - positive cocci , such as Streptococcus pneumoniae , is important for the development of new antibiotics . The study of modern microbiology shows that mevalonate pathway is a potential drug target . We choose HMG - CoA synthetase and HMG - CoA reductase as target enzyme to study the mechanism of the inhibitor on the normal physiological metabolism of Streptococcus pneumoniae , thus preventing the metabolic pathway of mevalonate which is dependent on the survival of pathogenic bacteria .



A three - dimensional structure model of Streptococcus pneumoniae HMG - CoA synthetase ( HMGS ) and HMG - CoA reductase ( HMGR ) gene was cloned and expressed by genetic engineering technique . The three - dimensional spatial structure model of Streptococcus pneumoniae HMG - CoA synthetase and HMG - CoA reductase was constructed .



1 . The HMGS gene was cloned from the genomic DNA of Streptococcus pneumoniae . The gene sequence analysis showed that the gene was 98 . 5 % homologous to the reported Streptococcus pneumoniae HMGS gene ( No . AF290098 ) , and there were 18 nucleotides , which resulted in the alteration of the encoded amino acids , which were Asn259 鈫，

本文編號：2104053