本文選題：HSP10 + 腺病毒載體��； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】：目的:熱休克蛋白10(heat shock protein 10,HSP10)又稱CPN10、GROES或HSPE1,屬于小分子熱休克蛋白家族成員,主要作為一種分子伴侶蛋白,與HSP60協(xié)同,在蛋白質(zhì)折疊中發(fā)揮作用;HSP10還參與細(xì)胞周期調(diào)控、核質(zhì)運(yùn)輸和新陳代謝。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),HSP10蛋白水平在多囊卵巢綜合征患者卵巢組織中的表達(dá)明顯低于正常人卵巢組織。但是,有關(guān)HSP10蛋白在多囊卵巢綜合征發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用尚未有過(guò)報(bào)道。本研究通過(guò)構(gòu)建小鼠HSP10基因siRNA和超表達(dá)重組腺病毒載體及體外培養(yǎng)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)HSP10基因在小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)抑制和超表達(dá);觀察改變HSP10基因表達(dá)后卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。通過(guò)該研究,探討HSP10在卵巢顆粒細(xì)胞中的生理功能,并為研究HSP10在多囊卵巢綜合征病理生理機(jī)制中的作用提供依據(jù)。 方法: (1)根據(jù)siRNA靶序列設(shè)計(jì)2條互補(bǔ)的64bp寡核苷酸,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pShuttle-H1-siRNA,再與穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV進(jìn)行連接,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pATC-H1-siRNA。pATC-H1-siRNA經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后,通過(guò)“兩步轉(zhuǎn)化法”分別將腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1和穿梭質(zhì)粒pATC-H1-siRNA轉(zhuǎn)化至BJ-5183感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行同源重組得到AdCMV-H1-siRNA/HSP10重組腺病毒質(zhì)粒。繼而通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝和擴(kuò)增。AdCMV-H1-siRNA/HSP10轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞收集的病毒上清,重復(fù)感染AD-293細(xì)胞四次,實(shí)現(xiàn)病毒大量擴(kuò)增。(2)用RT-PCR的方法從小鼠卵巢組織中擴(kuò)增HSP10基因全長(zhǎng),克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pAdTrack-HSP10。分別將腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1和穿梭質(zhì)粒pAdTrack-HSP10轉(zhuǎn)化至BJ-5183感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行同源重組得到AdCMV-HSP10重組腺病毒質(zhì)粒。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝和擴(kuò)增。轉(zhuǎn)染后用收集的病毒上清重復(fù)感染細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)病毒大量擴(kuò)增。(3)每只標(biāo)準(zhǔn)克小鼠腹腔注射PMSG48小時(shí)后,取出雙側(cè)卵巢,獲得卵母細(xì)胞核卵丘細(xì)胞,加入透明質(zhì)酸酶消化使顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞分離,以相同密度接種入6孔培養(yǎng)板,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。(4)將AdCMV-H1-siRNA/HSP10及AdCMV-HSP10重組腺病毒直接加入培養(yǎng)液中感染小鼠卵巢顆粒細(xì)胞。病毒感染小鼠卵巢顆粒細(xì)胞48小時(shí)后分別提取蛋白,通過(guò)Western blot的方法驗(yàn)證HSP10在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)抑制和超表達(dá),應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL法檢測(cè)顆粒細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。 結(jié)果: (1)穿梭質(zhì)粒pShuttle-H1-siRNA經(jīng)雙酶切與測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功,進(jìn)一步與pAdTrack-CMV連接,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pATC-H1-siRNA,構(gòu)建成功了HSP10基因的siRNA重組腺病毒質(zhì)粒pAdCMV-H1-siRNA/HSP10和對(duì)照質(zhì)粒pAdCMVH1-siRNA/control。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞后經(jīng)過(guò)包裝、擴(kuò)增最終得到高滴度重組病毒,以GFP為標(biāo)志測(cè)定AdCMV-H1-siRNA/HSP10病毒滴度為109 U/ml,AdCMVH1-siRNA/control病毒滴度為108 U/ml。(2)從小鼠卵巢組織中擴(kuò)增出309bp的cDNA,測(cè)序證實(shí)為小鼠HSP10基因。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)BJ-5183細(xì)菌內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建了HSP10基因的重組腺病毒質(zhì)粒AdCMV-HSP10及對(duì)照質(zhì)粒AdCMV。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞后經(jīng)過(guò)包裝、擴(kuò)增最終得到高滴度重組病毒,以GFP為標(biāo)志測(cè)定AdCMV-HSP10病毒滴度為107 U/ml,AdCMV-GFP病毒滴度為108 U/ml。(3)成功進(jìn)行了小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng),實(shí)現(xiàn)了HSP10在小鼠卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抑制和超表達(dá)。與對(duì)照組相比,在HSP10表達(dá)抑制組中蛋白的表達(dá)水平明顯降低,兩組間差異顯著(p0.05)。同時(shí),與對(duì)照組相比,在HSP10超表達(dá)組中蛋白的表達(dá)水平明顯升高,兩組間差異顯著(p0.05)。(4)用細(xì)胞流式術(shù)、TUNEL法檢測(cè)了HSP10表達(dá)抑制和超表達(dá)后顆粒細(xì)胞的細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,表達(dá)抑制組中細(xì)胞凋亡率明顯增加,兩組間差異顯著(p0.05);超表達(dá)后,顆粒細(xì)胞的細(xì)胞凋亡明顯減少,兩組間差異顯著(p0.05)。 結(jié)論:(1)小鼠HSP10基因siRNA和超表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建為進(jìn)一步研究HSP10在PCOS發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。(2)HSP10在小鼠顆粒細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抑制后明顯促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡;超表達(dá)后顆粒細(xì)胞的細(xì)胞凋亡明顯減少。表明HSP10與顆粒細(xì)胞凋亡的生理機(jī)制相關(guān)。(3)從課題組前期結(jié)果和本文結(jié)果推論,在PCOS發(fā)生發(fā)展中卵巢HSP10表達(dá)降低,進(jìn)而誘導(dǎo)了顆粒細(xì)胞的凋亡。
[Abstract]:Objective : Heat shock protein 10 ( HSP10 ) , also known as CPN10 , GROES , or HSPE1 , is a member of small molecular heat shock protein family . It plays a role in protein folding . HSP10 plays a role in cell cycle regulation , nuclear transport and metabolism .

Methods : ( 1 ) The recombinant adenovirus vector of AdCMV - H1 - siRNA / HSP10 was cloned into BJ - 5183 competent bacteria . The recombinant adenovirus vector pAdTrack - H1 - siRNA / HSP10 was transformed into BJ - 5183 competent bacteria to obtain AdCMV - H1 - siRNA / HSP10 recombinant adenovirus plasmid . The recombinant adenovirus of AdCMV - H1 - siRNA / HSP10 and AdCMV - HSP10 was transfected into BJ - 5183 competent bacteria .

Results : ( 1 ) The recombinant plasmid pAdCMV - H1 - siRNA / HSP10 and control plasmid pAdCMVH1 - siRNA / control were constructed successfully . The recombinant plasmid pAdCMV - H1 - siRNA / HSP10 and control plasmid pAdCMVH1 - siRNA / control were constructed .

Conclusion : ( 1 ) The construction of HSP10 siRNA and overexpression recombinant adenovirus vector provides an experimental basis for further studying the role and mechanism of HSP10 in the development of PCOS .
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2093778