本文選題：幽門螺桿菌 + 原核表達(dá)　； 參考：《江蘇大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 目的:克隆并鑒定幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)NCTC 11637cagL編碼基因;原核表達(dá)并純化CagL融合蛋白;觀察其融合蛋白對細(xì)胞株GES-1表達(dá)IL-8 mRNA能力的影響,并探討cagL基因在H.pylori cag致病島(cagpathogenicity island,cag PAI)編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)(typeⅣsecretion system,TFSS)中的作用,為進(jìn)一步闡明H.pylori的致病機制奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.根據(jù)GenBank收錄的H.pylori 22695全基因組序列,設(shè)計擴增cagL基因的引物,利用PCR技術(shù)從H.pylori NCTC 11637基因組DNA中擴增獲取cagL基因,T-A克隆后進(jìn)行序列測定;并對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析研究; 2.構(gòu)建PET-28a(+)-cagL原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)宿主菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)陽性菌株表達(dá)后,SDS-PAGE法和Western Blot法鑒定目的蛋白,并用Ni~(2+)-NTA樹脂分離純化所表達(dá)的CagL融合蛋白; 3.將融合蛋白CagL與弗氏佐劑充分乳化后,免疫家兔,制備抗CagL多克隆抗體;酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清中抗體效價; 4.不同濃度的融合蛋白CagL與GES-1細(xì)胞作用一定時間后,提取細(xì)胞總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測IL-8 mRNA的表達(dá); 5.收集H.pylori,重懸并裂解菌體,經(jīng)高速離心分離得到各菌體組分蛋白,包括周質(zhì)間隙蛋白、胞質(zhì)蛋白及內(nèi)外膜蛋白;利用Western Blot法檢測CagL蛋白的亞細(xì)胞定位; 6.將制備的CagL多克隆抗體按不同比例與幽門螺桿菌共孵育后,分別加入至細(xì)胞GES-1中,作用一定時間后;Western Blot法檢測細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(cytotoxin-associated gene A,CagA)在抗體中和前后轉(zhuǎn)運的影響; 結(jié)果: 1.PCR擴增獲得的cagL基因全長為654 bp,編碼217aa,(申請GenBank的登錄號為GU937872)與GenBank公布的其它H.pylori菌株的基因序列同源性為96%～98%,氨基酸同源性為97%～99%,蛋白的相對分子質(zhì)量Mr約為32KDa,軟件預(yù)測顯示有多個明顯的具有抗原活性的結(jié)構(gòu)域。 2.成功構(gòu)建了PET-28a(+)-cagL原核表達(dá)載體,確定IPTG終濃度1mmol/L,溫度30℃,誘導(dǎo)時間4h為最佳誘導(dǎo)條件,經(jīng)SDS-PAGE及Western Blot法鑒定有目的蛋白表達(dá);通過Ni~(2+)-NTA樹脂分離純化目的蛋白,獲得原核表達(dá)的CagL融合蛋白。 3.獲得CagL融合蛋白多克隆抗體,效價為1:3.2×10~5。 4.CagL融合蛋白可誘導(dǎo)細(xì)胞GES-1表達(dá)IL-8 mRNA,并且該效應(yīng)呈濃度依賴性。 5.Western Blot結(jié)果顯示CagL蛋白定位于菌體內(nèi)外膜;經(jīng)CagL多克隆抗體中和作用后,其菌體轉(zhuǎn)運CagA的蛋白量隨抗體量的增加而逐漸降低,表明抗體中和作用后能夠抑制CagA蛋白的轉(zhuǎn)運。 結(jié)論: 本研究通過克隆表達(dá)cagL基因,獲得CagL融合蛋白;并且證實CagL可誘導(dǎo)細(xì)胞株GES-1表達(dá)IL-8 mRNA,該效應(yīng)呈濃度依賴性;CagL蛋白定位于菌體內(nèi)外膜,通過制備的CagL多克隆抗體中和作用后可抑制CagA蛋白的轉(zhuǎn)運。
[Abstract]:Objective: to clone and identify the encoding gene of Helicobacter pylori (H.pylori) NCTC 11637 cagL, express and purify CagL fusion protein in prokaryotic, and observe the effect of the fusion protein on the expression of IL-8 mRNA in cell line GES-1. To investigate the role of cagL gene in type 鈪，

本文編號：2092980