本文選題：柯薩奇病毒 + CVB3�。� 參考：《南昌大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 目的: 探討CVB3(Coxsackievirus B3)對(duì)Hela(Henrietta Lacks strain of cancer cells)細(xì)胞高爾基體及其細(xì)胞周期的影響,為研究CVB3的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法: 將Hela細(xì)胞株作為敏感宿主細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn),用MOI(multiplicity of infection)為5的CVB3感染細(xì)胞: 1、免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)病毒感染后0 h、1.5 h、3 h、4.5 h和6 h等時(shí)間點(diǎn)VP1、GM130(Golgi matrix protein 130)和GRASP65(Golgi reassembly stacking protein 65)在細(xì)胞中的定位; 2、選擇CVB3感染0 h、1.5 h、3 h、4.5 h、6 h、7.5 h、9 h、10.5 h、12 h、13.5 h、15 h、16.5 h、18 h、21 h和24 h等時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,進(jìn)行總蛋白定量后,Western Blot檢測(cè)VP1、GM130和GRASP65蛋白的表達(dá)變化; 3、分別選擇G1/S期或G2/M期同步化細(xì)胞釋放0 h、3 h、6 h和9 h等時(shí)間點(diǎn),流式細(xì)胞儀檢測(cè)CVB3病毒感染組與正常細(xì)胞組之間的細(xì)胞周期差異。 結(jié)果: 1、免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示: (1)GM130和GRASP65的免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示:GM130與GRASP65之間存在明顯共定位,正常Hela細(xì)胞高爾基體位于近核區(qū),高爾基帶連續(xù)。 (2)GM130和VP1的免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示:正常細(xì)胞GM130免疫熒光呈帶狀分布,位于近核區(qū);而自病毒感染3 h后,GM130的熒光在病毒感染細(xì)胞中出現(xiàn)散點(diǎn)狀分布。 (3)GRASP65和VP1的免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示:正常細(xì)胞GRASP65免疫熒光呈帶狀分布,位于近核區(qū);而自病毒感染3 h后,GRASP65的熒光開始出現(xiàn)較明顯的彌散分布。 2、Western blot結(jié)果顯示:GM130的表達(dá)量自病毒感染后逐漸下降,至病毒感染18 h后未檢測(cè)出GM130的表達(dá);GRASP65的表達(dá)量變化趨勢(shì)與GM130基本一致,但病毒感染12 h后即未檢測(cè)出其表達(dá);VP1的蛋白表達(dá)量自病毒感染開始即持續(xù)上升,6 h后一直維持在較高水平。 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示: (1)對(duì)胸苷雙阻斷法同步在G1/S期的細(xì)胞,釋放0 h、3 h、6 h和9 h后,正常細(xì)胞組G1期的細(xì)胞比例分別是:89.14%、65.77%、14.14%和13.11%;而病毒感染細(xì)胞組G1期細(xì)胞比例分別是:91.08%、84.41%、81.81%和81.74%。 (2)經(jīng)諾考達(dá)唑(Nocodazole)作用后,G2期的細(xì)胞比例由非同步化狀態(tài)時(shí)的4.62%上升到40%以上,表明諾考達(dá)唑已將部分細(xì)胞同步化G2/M期;同步化釋放0 h、3 h、6 h和9 h后,正常細(xì)胞組G2期細(xì)胞比例分別是:42.99%、51.93%、37.97%和21.35%;而病毒感染細(xì)胞組G2期細(xì)胞比例分別是:61.25%、43.34%、29.37%和27.62%,與此同時(shí)G1期細(xì)胞比例分別是:8.48%、28.01%、28.10%和33.46%。 結(jié)論: 1、CVB3感染引起Hela細(xì)胞高爾基帶斷裂,高爾基體結(jié)構(gòu)受到影響。這可能是CVB3感染導(dǎo)致宿主細(xì)胞病變效應(yīng)的機(jī)制之一。 2、CVB3感染下調(diào)了GM130和GRASP65的表達(dá)。GM130和GRASP65的蛋白表達(dá)下降可能是高爾基體結(jié)構(gòu)破壞的機(jī)制之一。 3、CVB3感染G1/S期細(xì)胞后,細(xì)胞周期主要停滯在G1期,但CVB3并不阻滯G2期細(xì)胞。
[Abstract]:Objective: to investigate the effects of Coxsackievirus B3 (CVB3) on Golgi body and cell cycle of Hela (Henrietta packs strain of cancer cells) cells, and to provide a basis for the study of the pathogenesis of CVB3. Methods: Hela cell lines were used as sensitive host cells. The location of VP1GM130 (Golgi matrix protein 130) and GRASP65 (Golgi reassembly stacking protein 65) at 0 h, 1.5 h, 3 h, 4.5 h and 6 h after infection were detected by immunofluorescence double labeling. 2. The cells were collected at the time points of 0 h, 1.5 h, 3 h, 4.5 h, 7.5 h, 9 h, 10.5 h, 12 h, 13.5 h, 15 h, 16.5 h, 18 h, 21 h and 24 h of CVB3 infection, respectively. The expression of GM130 and GRASP65 was detected by Western Blot after total protein quantification. 3, the time points of release of the cells from G1 / S phase or G2 / M phase were 0 h ~ 3 h ~ 6 h and 9 h, respectively, and the expression of GM130 and GRASP65 protein was detected by Western blot. The difference of cell cycle between CVB 3 infection group and normal cell group was detected by flow cytometry. Results: 1. The results of immunofluorescence double labeling showed: (1) the immunofluorescence double labeling results of GM130 and GRASP65 showed that there was obvious co-localization between GM130 and GRASP65, and the Golgi body of normal Hela cells was located in the proximal nucleus. (2) the immunofluorescence double labeling of GM130 and VP1 showed that the GM130 immunofluorescence of normal cells was zonal and located in the proximal nucleus; The fluorescence of GM130 was scattered in the infected cells 3 hours after the virus infection. (3) the immunofluorescence double labeling results of GRASP65 and VP1 showed that the immunofluorescence of GM130 in normal cells was banded and located in the proximal nuclear region. However, the fluorescence distribution of GRASP65 began to appear obviously after 3 h of virus infection. 2 the results of Western blot showed that the expression of GM130 decreased gradually after virus infection. No GM130 expression was detected at 18 h after infection, and the trend of GM130 expression was basically the same as that of GM130. However, the expression of VP1 protein was not detected 12 h after infection. The expression of VP1 protein was maintained at a relatively high level after 6 h of continuous increase from the beginning of virus infection. 3. The results of flow cytometry showed that: (1) the cells in G 1 / S phase were synchronized by double blocking of thymidine. 3 h and 9 h after 0 h release. The percentage of G1 phase cells in normal cell group was 14.14% and 13.11%, respectively, while that in virus infected cell group was 84.41% and 81.74%, respectively. (2) the proportion of cells in G2 phase after treatment with Nocodazole was non-synchronous. When 4.62% rose to more than 40%, The results showed that Nordazol had synchronized G2 / M phase of some cells, and released 0 h ~ 3 h ~ 6 h and 9 h after release of G _ 2 / M phase. The proportion of G2 phase cells in normal cells group was 51.933% and 21.35%, respectively, while in virus infected cells group, the proportion of G2 phase cells was 29.37% and 27.62%, respectively, while the G1 phase cell proportion was 28.0128.10% and 33.4646%, respectively. Conclusion: 1 the Golgi band of Hela cells was broken and the Golgi body structure was affected by CVB3 infection. This may be one of the mechanisms by which CVB3 infection induces the host cytopathic effect. 2 the down-regulation of the expression of GM130 and GRASP65. GM130 and GRASP65 may be one of the mechanisms of the destruction of Golgi body structure. 3After the infection of G1 / S phase cells with CVB3, Cell cycle was mainly arrested in G 1 phase, but CVB 3 did not block G 2 phase cells.
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2092966