發(fā)布時(shí)間：2018-06-30 03:12

  本文選題：肺炎克雷伯菌 + 整合酶��； 參考：《大連醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 目的：肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,KP)是臨床上常見的條件致病菌,具有較高的耐藥性。了解肺炎克雷伯菌耐藥現(xiàn)狀,為臨床治療提供指導(dǎo)；整合子是一種可以移動(dòng)的基因元件,通過位點(diǎn)特異的基因重組在臨床細(xì)菌耐藥性傳播中起重要作用。了解Ⅰ類整合子在肺炎克雷伯菌中的分布狀況,分析它在多重耐藥中的作用；細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌附著在有生命或無生命的材料表面后,由細(xì)菌及其所分泌的胞外多聚物(主要是胞外多糖)共同組成的呈膜狀的細(xì)菌群體。研究表明,生物被膜菌的性質(zhì)與浮游菌有所不同,它可以增加對(duì)抗生素的抵抗能力。肺炎克雷伯菌形成生物膜是其重要的毒力因子,檢測肺炎克雷伯菌Ⅰ類整合酶基因在生物被膜狀態(tài)和浮游狀態(tài)表達(dá)水平的差異,探討整合子的作用機(jī)制。 方法：收集肺炎克雷伯菌共123株,藥敏實(shí)驗(yàn)了解其耐藥情況,設(shè)計(jì)合成Ⅰ類整合酶、Ⅰ類整合子可變區(qū)的上下游引物,煮沸法提取細(xì)菌總DNA作為模板,整合子可變區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測序,所得序列在Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析。將Ⅰ類整合酶陽性的肺炎克雷伯菌分別進(jìn)行普通液相培養(yǎng)和生物被膜培養(yǎng),提取各菌株兩種狀態(tài)下的總RNA。通過RT-PCR半定量方法,以細(xì)菌的16sRNA為內(nèi)參照,分別測定整合酶基因在生物被膜狀態(tài)和浮游狀態(tài)下的各自表達(dá)量。 結(jié)果：1.收集的肺炎克雷伯菌株中,經(jīng)過藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類藥物抗生素有較高的耐藥率：哌拉西林(100%)、頭孢曲松(76%)、左氧氟沙星(60%)、妥布霉素(60%)、復(fù)方新諾明(63%),所有菌株均對(duì)美羅培南敏感。 2.Ⅰ類整合酶基因在臨床分離的肺炎克雷伯菌中較為常見,123株細(xì)菌中檢出Ⅰ類整合酶陽性菌47株,檢出率為38.2%。Ⅰ類整合子陽性菌株對(duì)8種抗菌藥物的耐藥率與陰性菌株有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2檢驗(yàn),P＜0.05)。47株整合酶陽性菌株,進(jìn)行Ⅰ類整合子可變區(qū)擴(kuò)增,其中23株有陽性擴(kuò)增產(chǎn)物,陽性擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小含680bp,1600bp,2400bp三類。主要為aadA2和dfrA12基因,aadA2基因編碼鏈霉素3'-腺苷�；D(zhuǎn)移酶,介導(dǎo)對(duì)鏈霉素和壯觀霉素抗藥性；dfrA12基因編碼蛋白介導(dǎo)甲氧芐氨嘧啶的抗藥性。dfrA12-orfF-aadA2是最常見的基因盒排列方式。 3.試驗(yàn)檢測到肺炎克雷伯浮游菌和生物被膜菌均有intⅠ1的表達(dá)。菌株在兩種狀態(tài)下intⅠ1 mRNA的表達(dá)量不同,生物膜細(xì)菌intⅠ1基因的表達(dá)水平較高。在普通液態(tài)培養(yǎng)組Ⅰ類整合酶基因表達(dá)量為0.08±0.05,而在生物被膜狀態(tài)組Ⅰ類整合酶基因表達(dá)量則為0.28±0.004。生物膜狀態(tài)整合酶基因表達(dá)量約為浮游狀態(tài)的3倍。 結(jié)論：藥敏實(shí)驗(yàn)證實(shí)KP臨床菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類藥物抗生素有較高的耐藥率。Ⅰ類整合子在臨床分離的肺炎克雷伯菌株中廣泛存在(整合酶檢出率38.2%),耐藥情況較為嚴(yán)峻(16種抗生素中有9種耐藥率超50%)。整合子中的耐藥基因盒與其抗藥性密切相關(guān)。Ⅰ類整合酶基因在生物被膜狀態(tài)下mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),提示肺炎克雷伯菌生物被膜的形成有利于整合子及相關(guān)耐藥基因的表達(dá),整合子在生物膜細(xì)菌中可進(jìn)行更加活躍的基因盒捕獲和積累,整合子和細(xì)菌生物膜的形成是導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥的重要機(jī)制。
[Abstract]:Objective: Klebsiella Pneumoniae (KP) is a common clinical pathogen with high drug resistance. Understanding the current drug resistance of Klebsiella pneumoniae to provide guidance for clinical treatment. The integron is a kind of mobile gene element that can be used in the spread of clinical bacterial resistance through gene recombination in loci. Important role. To understand the distribution of class I integrons in Klebsiella pneumoniae, and to analyze its role in multidrug resistance; bacterial biofilm is a membrane like bacterial colony formed by bacteria and their secreted extracellular polymers (mainly extracellular polysaccharides) after they are attached to the surface of life or inanimate materials. The study shows that the nature of biofilm is different from that of planktonic bacteria. It can increase the resistance to antibiotics. Klebsiella pneumoniae is an important virulence factor to detect the difference of the level of the integrase gene of Klebsiella pneumoniae type I integrase gene in the biofilm state and the floating state, and to explore the mechanism of the integron.
Methods: 123 strains of Klebsiella pneumoniae were collected and the drug sensitivity test was used to understand the drug resistance. The first class integrase was synthesized, the upper and downstream primers of class I integron variable region were primed, the total DNA of bacteria was extracted by boiling method as a template, and the PCR amplification product of the integron variable region was purified and sequenced. The sequence of the obtained sequence was compared and analyzed in the Genbank database. The co enzyme positive Klebsiella pneumoniae were cultured in common liquid phase and biofilm culture respectively. The total RNA. in two states of each strain was extracted by RT-PCR semi quantitative method, and the 16sRNA of bacteria was used as internal reference to determine the respective expression of integrase gene in the state of biofilm and floating state respectively.
Results: 1. of the klebber strains collected, the drug sensitivity tests showed that they had high resistance rates to beta lactam, quinolones, aminoglycosides, sulfonamide antibiotics: piperacillin (100%), ceftriaxone (76%), levofloxacin (60%), tufomycin (60%), and compound novamamine (63%). All strains were sensitive to meropenem. Feeling.
2. class I integrase gene was more common in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae, and 47 strains of integrase positive bacteria were detected in 123 bacteria. The detection rate was that the resistance rate of 38.2%. type I integron positive strains to 8 kinds of antibiotics and negative strains were statistically different (x2 test, P < 0.05).47 strain integrase positive strain, and carried out class I whole The mutable region of the zygote was amplified, 23 of which had positive amplification products, the size of positive amplification products contained 680bp, 1600bp, 2400bp three, mainly aadA2 and dfrA12 gene, aadA2 gene encoding streptomycin 3'- adenosine acyltransferase, mediating resistance to streptomycin and splendenin; dfrA12 gene encoding protein mediated methoxyl pyrimidine. Sex.DfrA12-orfF-aadA2 is the most common way of gene cassette arrangement.
The 3. test detected the expression of int i 1 of Klebsiella pneumoniae and biofilm bacteria. The expression of int i 1 mRNA was different in two states, and the expression level of int i 1 gene was higher in the biofilm bacteria. The expression of class I integrase gene was 0.08 + 0.05 in the ordinary liquid culture group, and the type I integrase in the biofilm state group The expression level of gene was 0.28 + 0.004., and the expression of integrase gene in biofilm was 3 times that of planktonic state.
Conclusion: the drug sensitivity test confirmed that KP clinical strains have high resistance to beta lactam, quinolones, aminoglycosides, sulfonamide antibiotics. Class I integron exists widely in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae (integrase detection rate 38.2%), and the drug resistance is severe (9 kinds of antibiotics among 16 kinds of antibiotics are over 50%). The resistance gene box in the zygote is closely related to its resistance to drug resistance. Class I integrase gene is up-regulated at the mRNA transcriptional level in the biofilm state, suggesting that the formation of Klebsiella pneumoniae biofilm is beneficial to the expression of integrons and related resistance genes, and the integron can capture and accumulate more active gene boxes in biofilm bacteria. The formation of zygote and bacterial biofilm is an important mechanism leading to the antibiotic resistance of bacteria.
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R378

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